شناسایی ژن توکسین شوک توکسیک در استافیلوکوکوس اورئوس های جداشده از نمونه های شیر مشكوك به ورم پستان در گاوداری های صنعتی همدان

مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….1

فصل اول- كليات………………………………………………………………………………………………………………………………..5

1-1- ورم پستان………………………………………………………………………………………………………………………………………..5

1-2- اهمیت ورم پستان در گاو……………………………………………………………………………………………………………….5

1-3- عوامل ايجاد كننده ورم پستان………………………………………………………………………………………………………..5

         1-3-1- عوامل خطر ساز و مستعد کننده ورم پستان……………………………………………………………………………………………..5

             1-3-1-1- ویژگی های انفرادی میزبان……………………………………………………………………………………………………………………………………………………5

            1-3-1-2- روش نگهداری و محیط…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………6

            1-3-1-3- ویژگی های عامل بیماری زا…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..6

        1-3-2- عوامل بیماری زای اصلی……………………………………………………………………………………………………………………………..6

1-4- انواع ورم پستان بر حسب عوامل ایجاد كننده آن………………………………………………………………………….6

         1-4-1- ورم پستان محیطی……………………………………………………………………………………………………………………………………..6

         1-4-2- ورم پستان مسری………………………………………………………………………………………………………………………………………..7

1-5- انواع ورم پستان بر حسب شدت نشانه های بالینی……………………………………………………………………….8

         1-5-1- ورم پستان بالینی…………………………………………………………………………………………………………………………………………8

            1-5-1-1- ورم پستان فوق حاد…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………8

            1-5-1-2- ورم پستان حاد…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………8

            1-5-1-3- ورم پستان تحت حاد……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….8

            1-5-1-4- ورم پستان مزمن………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………8

         1-5-2- ورم پستان تحت بالینی……………………………………………………………………………………………………………………………….9

1-6- ورم پستان ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس………………………………………………………………………………….9

         1-6-1- نشانه های بالینی………………………………………………………………………………………………………………………………………….9

1-7- شاخص های تشخیص ورم پستان…………………………………………………………………………………………………..10

         1-7-1- شمارش مستقیم سلول های سوماتیك………………………………………………………………………………………………………10

         1-7-2- برآورد غیرمستقیم سلول های سوماتیك………………………………………………………………………………………………….. 11

         1-7-3- بررسی ميكروبی……………………………………………………………………………………………………………………………………………12

1-8- كنترل ورم پستان استافیلوكوكی…………………………………………………………………………………………………….12

1-9- درمان ورم پستان استافیلوكوكی……………………………………………………………………………………………………..12

1-10- جنس استافیلوكوكوس …………………………………………………………………………………………………………………13

         1-10-1- تاریخچه و طبقه بندی………………………………………………………………………………………………………………………………13

         1-10-2- اپیدمیولوژی……………………………………………………………………………………………………………………………………………….14

         1-10-3- مورفولوژی و مشخصات……………………………………………………………………………………………………………………………..17

1-11- استافيلوكوكوس اورئوس………………………………………………………………………………………………………………..18

1-12- فاكتور های بیمای زایی…………………………………………………………………………………………………………………18

         1-12-1- ساختمان آنتی ژنی……………………………………………………………………………………………………………………………………19

             1-12-2-1- غشای سیتوپلاسمی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….19

              1-12-2-2- پپتیدوگليكان………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….19

              1-12-2-3- تيكوئیك اسید………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..19

              1-12-2-4- پروتئین A……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..20

              1-12-2-5- كپسول یا گلیكوكالیس………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….20

         1-12-2- تركیبات خارج سلولی………………………………………………………………………………………………………………………………..20

             1-12-2-1- آنزیم ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………20

             1-12-2-1- توكسین ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………21

1-13- توكسين شوك توكسیك………………………………………………………………………………………………………………24

         1-13-1- ساختار سه بعدی……………………………………………………………………………………………………………………………………….25

         1-13-2- شرایط ترشح………………………………………………………………………………………………………………………………………………25

         1-13-3- مكانیسم عمل…………………………………………………………………………………………………………………………………………….26

         1-13-4- بیماری زایی……………………………………………………………………………………………………………………………………………….26

             1-13-4-1- سندرم شوك توكسیك…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………27

             1-13-4-2- سندرم كاوازاكی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 28

1-14- تشخيص آزمايشگاهی استافیلوكوكوس اورئوس……………………………………………………………………………28

         1-14-1- روش ميكروسكوپی…………………………………………………………………………………………………………………………………….28

         1-14-2- تست های بيوشيميايی………………………………………………………………………………………………………………………………28

         1-14-3- واكنش زنجیره ای پلیمراز…………………………………………………………………………………………………………………………28

1-15- مقاومت دارویی………………………………………………………………………………………………………………………………29

1-16- درمان……………………………………………………………………………………………………………………………………………..30

فصل دوم- مواد و روش ها……………………………………………………………………………………………………………..31

2-1- مواد مصرفی……………………………………………………………………………………………………………………………………..32

2-2- مواد غير مصرفی………………………………………………………………………………………………………………………………33

2-3- جمع آوری نمونه……………………………………………………………………………………………………………………………..35

2-4- تست ورم پستان کالیفرنیا……………………………………………………………………………………………………………….36

2-5- شمارش سلول های سوماتیك…………………………………………………………………………………………………………37

2-6- شناسایی و جداسازی استافیلوكوكوس اورئوس……………………………………………………………………………….37

         2-6-1- کشت بر روی محیط آگار خوندار………………………………………………………………………………………………………………..37

         2-6-2- رنگ آميزی گرم…………………………………………………………………………………………………………………………………………..38

         2-6-3- آزمايش كاتالاز……………………………………………………………………………………………………………………………………………..38

         2-6-4- کشت بر روی محیط برد پارکر آگار……………………………………………………………………………………………………………38

         2-6-5- کشت بر روی محیط مانیتول سالت آگار………………………………………………………………………………………………….39

         2-6-6-کشت بر روی محیط   DNaseآگار……………………………………………………………………………………………………………39

         2-6-7- تست كواگولاز………………………………………………………………………………………………………………………………………………40

2-7- ذخيره نمونه ها………………………………………………………………………………………………………………………………..41

2-8- استخراج  DNA…………………………………………………………………………………………………………………………….42

         2-8-1- روش تهیه بافر لیزكننده ……………………………………………………………………………………………………………………………42

2-9- Multiplex PCR ……………………………………………………………………………………………………………………….42

         2-9-1- برنامه حرارتی دستگاه ترمال سایكلر……………………………………………………………………………………………………………43

         2-9-2- مراحل انجام الکتروفورز…………………………………………………………………………………………………………………………………..44

             2-9-2-1- آماده سازی  ژل آگارز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..44

             2-9-2-2- بار گذاری نمونه ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….44

             2-9-2-3- الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..45

              2-9-2-4- قرائت نتایج الکتروفورز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..45

2-10- آنالیز آماری داده ها……………………………………………………………………………………………………………………….45

فصل سوم- نتايج و بحث…………………………………………………………………………………………………………………46

3-1- نتايج…………………………………………………………………………………………………………………………………………………47

3-2- بحث ………………………………………………………………………………………………………………………………………………..58

پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………………………………………………….64

منابع و ماخذ……………………………………………………………………………………………………………………………………………….66

جدول1-1. نحوه گزارش تست كالیفرنیایی ورم پستان……………………………………………………………………………………………………………………………..11 جدول1-2. استافیلوكوك های كواگولاز مثبت و اهمیت بالینی آنها………………………………………………………………………………………………………….15 جدول1-3. استافیلوكوك های كواگولاز منفی جدا شده از حیوانات…………………………………………………………………………………………………………17 جدول2-1. مشخصات گاوداری های صنعتی مراجعه شده طی دو فصل گرم و خشك و سرد و مرطوب………………………………………………..36 جدول2-2. ویژگی های گونه های استافیلوكوك كواگولاز مثبت………………………………………………………………………………………………………………40 جدول2-3. پرایمرهای به كار رفته و اندازه محصولات مورد انتظار……………………………………………………………………………………………………………43 جدول2-4. برنامه دمایی و زمانی جهت شناسایی ژن های  femA و tst………………………………………………………………………………………………..44 جدول3-1. نتایج تست ورم پستان كالیفرنیا و شمارش سلول های سوماتیك در فصل گرم و خشك…………………………………………………….51 جدول3-2. نتایج تست ورم پستان كالیفرنیا و شمارش سلول های سوماتیك در فصل سرد و مرطوب………………………………………………….52 جدول3-3. ارتباط بین تست های CMT و SCC با كشت میكروبی…………………………………………………………………………………………………….52 جدول3-4. فراوانی باکتری های گرم مثبت جدا شده از هر گاوداری طی دو فصل………………………………………………………………………………….52 جدول3-5. فراوانی باکتری های گرم منفی جدا شده از هر گاوداری طی دو فصل…………………………………………………………………………………..53 جدول3-6. فراوانی استافیلوکوکوس اورئوس های واجد ژن femA و tst جدا شده از هر گاوداری در فصل گرم و خشک……………………53 جدول3-7. فراوانی استافیلوکوکوس اورئوس های جدا شده واجد ژن femA و tst از هر گاوداری در فصل سرد و مرطوب………………….53

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شكل1-1. ساختار سه بعدی توكسین شوك توكسیك…………………………………………………………………………………………………………………………….25 شكل2-1. مراحل نمونه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..36 شكل2-2. نمای شماتیك از تست كواگولاز به روش لام………………………………………………………………………………………………………………………….41 شكل2-3. نمایی از روش لام كواگولاز مثبت و نمونه های از استافیلوكوكوس اورئوس های كواگولاز مثبت در سمت چپ…………………41 شكل3-1. نمونه CMT مثبت…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………47 شكل3-2. نمایی از لام های رنگ آمیزی شده جهت شمارش سلول های سوماتیك…………………………………………………………………………….47 شكل3-3. نمای میكروسكوپی شمارش سلول های سوماتیك(X 100)………………………………………………………………………………………………..48 شكل3-4. كلنی های مشكوك به استافیلوكوكوس اورئوس فاقد همولیز بر روی محیط كشت آگار خوندار…………………………………………48 شكل3-5. كلنی های مشكوك به استافیلوكوكوس اورئوس واجد همولیز بر روی محیط كشت آگار خوندار………………………………………..49 شكل3-6. نمای میكروسكوپی از رنگ آمیزی گرم جدایه های مشكوك…………………………………………………………………………………………………49 شكل3-7. نمونه ای از تست كاتالاز  بر روی جدایه های مشكوك…………………………………………………………………………………………………………..49 شكل3-8. محیط كشت برد پاركر آگار و احیای تلوریت (سیاه شدن كلنی ها) و تجزیه لسیتین و لیپید(ایجاد هاله اطراف كلنی) توسط استافیلوكوكوس اورئوس…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….50 شكل3-9. محیط كشت مانیتول سالت آگار و تخمیر مانیتول (قسمت زرد شده) توسط استافیلوكوكوس اورئوس ……………………………..50 شكل3-10. محیط كشت DNase آگار و ایجاد هاله شفاف اطراف كلنی توسط استافیلوكوكوس اورئوس…………………………………………..50 شكل3-11. نتایج الكتروفورز جدایه ای استافیلوكوكوس اورئوس جهت شناسایی ژن femA و tst با روش Multiplex PCR…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………57 نمودار3-1. نتایج تست ورم پستان کالیفرنیا در فصل گرم و خشک/ سرد و مرطوب (به درصد) و معنی دار نبودن نتایج آن (05/0 <α)…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….55 نمودار3-2. نتایج شمارش سلول های سوماتیک در فصل گرم و خشک/ فصل سرد و مرطوب (به درصد) و معنی دار نبودن نتایج آن (05/0 <α)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..55 نمودار3-3. فراوانی استافیلوکوکوس اورئوس های واجد ژن femA جدا شده از هر گاوداری در فصل گرم و خشک/ فصل سرد و مرطوب (به درصد) و معنی دار بودن نتایج آن (05/0 >α)…………………………………………………………………………………………………………………………………..56 نمودار3-4. فراوانی كل استافیلوکوکوس اورئوس های واجد ژن های fem A  و  tst جدا شده در فصل گرم و خشک/ فصل سرد و مرطوب (به درصد) و معنی دار بودن نتایج آن (05/0 >α)……………………………………………………………………………………………………………………..56