%34تخفیف

جداسازی، ژنوتایپینگ و توالی یابی بخشی از ژن فیوژن و تعیین جایگاه فیلوژنتیک ویروس نیوکاسل ‏ولوژنیک ویسروتروپیک دخیل درواگیری اخیر استان ایلام

تعداد 147 صفحه فایل word

چکیده:

بیماری نیوکاسل ولوژنیک، از مهمترین بیماری‌های ویروسی پرندگان به ویژه ماکیان است که همه ساله خسارات اقتصادی وسیعی را در صنعت طیور کشور های در حال توسعه به جا می گذارد. عامل بیماری یک RNA ویروس از خانواده پارامیکسوویریده است. پارامیکسوویروس تیپ یک ماکیان (APMV-1) نامی ست که برای ویروس نیوکاسل پیشنهاد شده است. در چند سال اخیر همه گیری نیوکاسل ولوژنیک کشورهای منطقه از جمله ایران مطرح است. با توجه به مشاهده موارد متعدد بیماری در استان ایلام، از نمونه های بالینی تیپیک بیماری نیوکاسل، نمونه برداری از مغز صورت پذیرفت. پس از هموژن نمودن نمونه مغز، از مایع رویی آن برای تزریق در تخم مرغ جنین دار 9 روزه استفاده گردید. پس از پاساژ متوالی مایع آلانتوئیک جنین های تلف شده از روز دوم هر پاساژ جمع آوری و مورد آزمایش HA قرار گرفت. ویروس تکثیر شده با قابلیت هماگلوتیناسیون برای تایید هویت پارامیکسوویروسی آن با آنتی سرم ضد ویروس نیوکاسل در تست HI مورد آزمایش واقع شد. مایع آلانتوئیک حاوی ویروس برای استخراج RNA استفاده شد. سپس بخشی از ژنوم ویروس حاوی ناحیه پوشش دهنده محل شکافت پروتئین فیوژن که یک مارکر مولکولی برای پاتوتایپ های ولوژنیک است، به روش RT-PCR تکثیر کردید. امپلیکون حاصله توالی یابی نوکلئوتیدی گردید. براساس توالی های حاصله آنالیز فیلوژنتیک جهت تعیین ژنوتیپ انجام شد. فرآیند های جداسازی، استخراج، سنتز cDNA و واکنش زنجیره ای پلیمراز (RT-PCR) و تعیین توالی با موفقیت به انجام رسیده و هویت نیوکاسل ولوژنیک ویروس را تایید نمود. توالی اسید آمینه ناحیه شکافت پروتئین فیوژن 112-RRQKRF-117 بود. این توالی همانند همه پاتوتیپ های با حدت بالا، دارای بیش از دو اسید آمینه‌ی بازی در ناحیه‌ی فوق الذکر بود و اسید آمینه‌ی شماره‌ی 117 آن نیز فنیل‌آلانین تشخیص داده شد. بر اساس آنالیز فیلوژنتیکی جدایه نیوکاسل ایلام متعلق به کلاس II و ژنوتیپ VII و تحت ژنوتیپ VIId بود.. در رسم درخت فیلوژنتیک ویروس نیوکاسل جدایه استان ایلام به همراه جدایه های خراسان و سمنان(دامغان) در کنار جدایه هایی ازکشورهای عربستان سعودی،کره جنوبی ، چین،اندونزی، تایوان،که همگی متعلق به ژنوتیپ VII(عمدتا ژنوتیپ VIId) هستند، در یک ژنوتیپ یکسان (VII) قرار گرفت.براساس نتایج این پژوهش ژنوتیپ شایع در اپیدمی سال های اخیر ژنوتیپ VIId و شیوع آن در شرق و مرکز و غرب ایران می باشد که بیشترین تشابه را با جدایه هایی از عربستان سعودی و کشورهای آسیای جنوب شرقی دارا می باشد.این الگوی فیلوژنی می تواند مبین این باشدکه اپیدمی سال های اخیر در منطقه و ایران ممکن است با منشاء آسیای جنوب شرقی باشد. انجام مطالعات گسترده تر در سطح کشور و مقایسه با توالی های بیشتری در بانک های اطلاعاتی اطلاعات جامع تری را از منظر مولکولار در اپیدمیولوژی روشن خواهد ساخت.

کلمات کلیدی: ویروس نیوکاسل ،RT-PCR، ژن فیوژن، درخت فیلوژنتیک، ژنوتیپVIId، ایلام

فهرست مطالب

فصل اول : 2

کلیات… 2

1-1 بیماری نیوکاسل: 3

1-1-1 تاریخچه بیماری نیوکاسل : 3

1-1-2 تاریخچه بیماری نیوکاسل در ایران : 5

1-2 سبب شناسی.. 5

1-2-1 خانواده پارامیکسوویریده : 5

1-3 ویروس نیوکاسل : 7

1-3-1 مشخصات ظاهری , شیمیایی و بیولوژی ویروس : 7

1-3-2 حساسیت ویروس به عوامل فیزیکی وشیمیایی : 10

1-3-3 سویه های ویروس : 11

1-3-4 تکثیر ویروس… 12

1-4 میزبان های حساس : 13

1-5 دوره کمون : 14

1-6 علائم کلینیکی : 14

1-7 علائم کالبد گشایی: 15

1-8 ضایعات میکروسکوپی : 16

1-9 پاتوژنز بیماری : 16

1-10 اصول مولکولی در بیماریزایی نیوکاسل : 16

1-11 انتقال بیماری : 17

1-12 ایمنی در نیوکاسل : 19

1-12-1 ایمنی فعال : 19

1-12-2 ایمنی غیر فعال  : 20

1-12-3 سرکوب ایمنی : 21

1-13 تشخیص نیوکاسل: 21

1-13-1 تشخیص تفریقی علائم بالینی و کالبدگشایی : 21

1-13-2 جداسازی ویروس : 22

1-14 شناسایی ویروس : 23

1-14-1 تعیین پاتوژنسیته در بدن موجود زنده : 23

1-14-2-تعیین پاتوژنسیته در آزمایشگاه : 25

1-14-2-1 کشت سلول و ایجاد پلاک : 25

1-14-2-2 تعیین توالی نوکلئوتیدی : 26

1-15 سرولوژی : 26

1-15-1 آزمایش هماگلوتیناسیون(HA). 27

1-15-2 آزمایش ممانعت ازهماگلوتیناسیون(HI). 27

1-15-3-آزمایش خنثی سازی ویروس (VN). 28

1-16 تشخیص با روش های مولکولی : 28

1-16 -1-واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR): 29

1-16-2 اساس کار PCR  : 29

1-16-3 مراحل کار PCR : 30

1-16-4 آشکارسازی محصول PCR : 31

1-16-5واکنش زنجیره ای پلی مراز با نسخه برداری معکوسRT-PCR: 32

1-16-6 مواد مورد نیاز در واکنش PCR : 33

1-16-6-1 آنزیم DNA پلی مراز: 33

1-16-6-2-dNTPs دی اکسی نوکلئوتید تری فسفات ها : 34

1-16-6-3 پرایمر ها : 34

1-16-6-4 الگو یا هدف : 35

1-16-7 سیکل های PCR : 36

1-17 کنترل و پیشگیری از نیوکاسل : 37

1-17-1 کنترل در سطح بین المللی : 37

1-17-2 قوانین کنترل بیماری در سطح ملی : 38

1-17-3 کنترل و پیشگیری در سطح مزرعه پرورش : 38

1-17-4 واکسیناسیون : 39

1-17-4-1 واکسن های زنده : 39

1-17-4-2 واکسن های غیر فعال یا کشته : 41

1-17-4-3 واکسن های کلون شده : 41

1-17-4-4 واکسن های نوترکیب: 42

1-17-5 سیاست واکسیناسیون علیه بیماری  : 42

1-18 درمان : 42

1-19 تحقیقات انجام شده در ایران و جهان. 43

1-19-1 تحقیقات انجام شده در ایران. 43

1-19-2 مطالعات انجام شده در سایر کشورها 46

فصل دوم : 50

مواد و روش کار. 50

2-1- ﻣﻮاد، معرف ها و کیت های مصرفی.. 51

2-2- ﻟﻮازم و ﺗﺠﻬﯿﺰات مورد استفاده 52

2-3- آﻣﺎده ﺳﺎزي.. 53

2-4- روش ﮐﺎر کلی به اختصار. 54

‎‫‎‏2-4-1- ﺛﺒﺖ ﻣﺸﺨﺼﺎت ﮔﻠﻪي ﻣﺒﺘﻼ ﺑﻪ ﺑﯿﻤﺎري ﻧﯿﻮﮐﺎﺳﻞ ﺣﺎد ﻣﻄﺎﺑﻖ ﺑﺎ ﻓﺮم اﺳﺘﺎﻧﺪارد ‏OIE ‪ ‎ 55

‎‫‎‏2-4-2- ﻧﻤﻮﻧﻪ ﺑﺮداري و آﻣﺎده ﺳﺎزي ﻧﻤﻮﻧﻪ ﻣﻐﺰ ﺟﻬﺖ ﺟﺪاﺳﺎزي وﯾﺮوس‏‎‎… 55

‎‫‎‏2-4-3- ﺗﻠﻘﯿﺢ ﺑﻪ داﺧﻞ ﺗﺨﻢ ﻣﺮغ جنین دار ( ﮐﯿﺴﻪي آلانتوئیک) 56

شرح روش کار : 57

‎‫‎‏2-4-4- ﺟﻤﻊ آوري مایع آلانتوئیک‏‎…. 57

شرح روش کار : 58

‎‫‎‏2-4-5- تهیه ی ﮔﻠﺒﻮل ﻗﺮﻣﺰ 5/0 درﺻﺪ ﺟﻮﺟﻪ. 58

‏2-4-6- آزﻣﺎﯾﺶ هماگلوتیناسیون (‏‎‪‎‏)‏HA 59

‏2-4-7- ﺗﻬﯿﻪي ﺳﺮم ﺣﺎوي آﻧﺘﯽﺑﺎدي اﺧﺘﺼﺎﺻﯽ ﺟﻬﺖ اﻧﺠﺎم آزﻣﺎﯾﺶ ﻣﻤﺎﻧﻌﺖ از‏‎ ‎هماگلوتیناسیون ‏‏(‏‎‪‎‏)‏HI 60

‏2-4-8- آزﻣﺎﯾﺶ ﻣﻤﺎﻧﻌﺖ از هماگلوتیناسیون (‏‎‪‎‏)‏HI 60

2-4-9 استخراج RNA… 62

2-4-10 بررسی کمی و کیفی RNA… 63

2-4-11 انتخاب پرایمر. 63

2-4-12 ساخت DNA مکمل  (cDNA). 64

2-4-13 آزمایش PCR.. 64

2-4-14 بررسی محصولات PCR.. 65

2-4-15 خالص سازی محصولات PCR جهت تعیین توالی.. 66

2-4-16 تعیین توالی.. 67

2-4-17 ویرایش کروماتوگرام خام. 67

2-4-18 آنالیز توالی ها 67

2-4-18-1 جستجو در بانک های اطلاعات ژنی.. 67

2-4-18-2 ردیف نمودن چند گانه. 68

2-4-18-3 ترسیم ماتریکس تشابه. 68

2-4-19 ترسیم درخت فیلوژنی و شناسایی ژنوتیپ و دودمان جدایه های ویروس بیماری نیوکاسل.. 68

فصل سوم : 69

نتایج.. 69

3-1 علائم بالینی و کالبدگشایی.. 70

3-2 کشت ویروس… 74

3-3 آزمایش هماگلوتیناسیون HA و ممانعت از هماگلوتیناسیون HI. 74

3-4 بررسی کمی و کیفی RNA… 76

3-5 نتایج RT-PCR.. 76

3-6 تعیین توالی.. 77

3-7 ویرایش کروماتوگرام خام. 78

3-8 آنالیز توالی ها 80

3-8-1 جستجو در بانک های اطلاعات ژنی.. 80

3-9-2 ردیف نمودن چندگانه  یا Multiple Alignment توالی ها 84

3-10 آنالیز و ترسیم درخت فیلوژنی.. 108

فصل چهارم : 112

بحث و نتیجه گیری و پیشنهادات… 112

منابع و مراجع. 123

 

جداول

جدول) 1-1) تقسیم بندی سروتیپ‌های پارامیکسوویروس ماکیان. 7

جدول 1-2 چکیده‌ای از نشانه‌های بالینی در سویه‌های مختلف ویروس بیماری نیوکاسل.. 12

جدول 1-3 نمونه هایی از پاتوتیپ‌های مختلف ویروس بیماری نیوکاسل.. 12

جدول 1-4) تعدادی از پرایمرهای مورد استفاده در روش RT-PCR برای شناسایی سویه‌های مختلف ویروس بیماری نیوکاسل.. 35

جدول 1-5)واکسن‌های زنده‌ی بیماری نیوکاسل.. 40

جدول2-1)برنامه واکسیناسیون نیوکاسل و آنفولانزا 60

جدول3-1 اطلاعات گله. 70

جدول 3-2 نشانه های بالینی.. 71

جدول3-3 برنامه واکسیناسیون. 71

جدول3-4 جراحات کالبد گشایی.. 71

جدول3-5 ادامه جراحات کالبدگشایی.. 71

جدول 3-6 تعداد تلفات در جدول زیر آورده شده است: 74

جدول 3-7) نتیجه آزمایش هماگلوتیناسیون (HA) با چهار واحد HA.. 75

جدول 3-8) نتیجه آزمایش ممانعت از هماگلوتیناسیون (HI) با سرم حاوی آنتی‌بادی‌های اختصاصی.. 75

جدول3-9) نتیجه نانودراپ نمونه‌های RNA.. 76

جدول 3-10) توالی‌های نوکلئوتیدی دارای بیشترین تشابه با توالی‌های جدا شده در بانک‌های اطلاعات ژنی پایگاه اینترنتی NCBI. 80

جدول 3-11) توالی‌های آمینواسیدی دارای بیشترین تشابه با توالی‌های جدا شده در بانک‌های اطلاعات ژنی پایگاه اینترنتی NCBI. 83

جدول3 -12) توالی آمینواسیدی ناحیه‌ی شکافت پروتئین فیوژن (117-112) در پاتوتیپ‌های مختلف ویروس نیوکاسل.. 93

جدول 3-13) توالی آمینواسیدی ناحیه‌ی شکافت پروتئین فیوژن سویه‌های گزارش شده از ایران و کشورهای براساس طبقه بندی دودمان‌. 94

جدول 3-14) توالی آمینواسیدی ناحیه‌ی شکافت پروتئین فیوژن (رزیدوهای 112 تا 117 پروتئین فیوژن) 96

جدول 3-15-جدول پایین توالی های استفاده شده در این تحقیق جهت ترسیم درخت فیلوژنتیک…. 99

تصاویر

تصویر1-1:شکل شماتیک ویروس نیوکاسل و پروتئین های سطحی آن. 10

تصویر) 1-2) تصویر میکروسکوپ الکترونی ویروس بیماری نیوکاسل.. 10

تصویر 1-3 ساختار ژنومی ویروس بیماری نیوکاسل.. 10

تصویر1-4: شکل شماتیک مراحل مختلف PCR.. 31

تصویر1-5:در هر سیکل PCR مراحل تکرار می شوند. 37

تصویر2-1 میکروپلیت 96 گوده ای.. 59

تصویر 2-2 محل اتصال شدن پرایمرهای مورد استفاده در این تحقیق.. 63

تصویر 3-1) خونریزی خفیف و شدید در پیش معده 72

تصویر3-2) خونریزی و نکروز در کلیه. 72

تصویر 3-3) خونریزی و اولسر در لوزه‌ی روده‌ی کور. 73

تصویر 3-4) خونریزی و اولسر در روده باریک…. 73

تصویر 3-5 تصویر ژل الکتروفورز تعدادی از RNA های استخراج شده 76

تصویر3-7) ژل با درجه ذوب پایین مربوط به نمونه های‌ PCR مثبت… 78

تصویر 3-8 کروماتوگرام ویرایش شده از ایزوله ویروس NDV در ایلام. 79

تصویر 3-10) هم ردیفی توالی نوکلئوتیدی.. 84

تصویر 3-11) ادامه. 86

تصویر 3-12) ادامه. 87

تصویر 3-13) ادامه. 88

تصویر 3-14) هم ردیفی توالی.. 91

تصویر 3-15- شکل صفحه بعد ماتریکس تشابه و فاصله بین توالی.. 102

تصویر 3-16- شکل بالا ماتریکس تشابه و فاصله بین توالی های پروتئینی.. 106

تصویر 3-18- درخت فیلوژنی بر اساس توالی پروتئینی 47 رکورد مورد آنالیز. 110

ضمائم……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..130

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………133

 

18 دیدگاه برای جداسازی، ژنوتایپینگ و توالی یابی بخشی از ژن فیوژن و تعیین جایگاه فیلوژنتیک ویروس نیوکاسل ‏ولوژنیک ویسروتروپیک دخیل درواگیری اخیر استان ایلام

  1. ecwhVYRl

    These moieties are bidentate chelators that bind to metal ions through oxygen and nitrogen atoms discount cialis

  2. Caleb

    We arre a group off volunjteers annd opening a neww schene inn ouur community.
    Yoour website offered uss wwith valuable ifo to workk on. You have dne a formidaqble jjob
    annd our ntire commjunity will bbe grayeful to
    you.

    Herre is mmy site :: 010 [Jaxon]

  3. Twyla

    Heey there, You hace donne ann incredible job.

    I’ll definitely dig it annd personawlly rrecommend tto my friends.

    I’m connfident they will bbe benefited ffrom thius web site.

    Also vsit myy homepage: 027 [Claudette]

  4. Elisa

    Pretty! This has been an incredibly wonderful post.
    Many thanks for supplying this information.

    my site Latest Indian mms

  5. Julissa

    Hi there I am so happy I found your webpage, I really found you by
    mistake, while I was browsing on Bing for something else, Anyways I am here now
    and would just like to say thank you for a marvelous post and a all round thrilling blog (I also love the theme/design), I don’t have time to go through it all at the minute but
    I have saved it and also added your RSS feeds, so
    when I have time I will be back to read a great deal more, Please do
    keep up the awesome job.

    Here is my homepage; diablo 4 torrent game

  6. Penni

    I really like it when people come together and share views.
    Great blog, stick with it!

    Review my website: Domain

  7. Junior

    You could definitely see your enthusiasm in the work you write.
    The sector hopes for even more passionate writers like you who are not afraid to say how they believe.
    At all times follow your heart.

    Feel free to surf to my webpage make money online

  8. Tuyet

    Remarkable things here. I’m very happy to peer your post.

    Thank you a lot and I’m taking a look ahead to touch you.
    Will you kindly drop me a e-mail?

    my web site … tritium disposal

  9. Corinne

    It’s awesome in favor of me to have a site, which is beneficial designed for my
    know-how. thanks admin

    Feel free to surf to my website online calculator free full screen

  10. Cqlhtf

    alternatives to allergy medication allergy pills without antihistamine best allergy medicine without antihistamine

  11. Rastrear Teléfono Celular

    ¿Cómo sé con quién está chateando mi esposo o esposa en WhatsApp? Entonces ya estás buscando la mejor solución. Escuchar a escondidas en un teléfono es mucho más fácil de lo que cree. Lo primero que debe instalar una aplicación espía en su teléfono es obtener el teléfono objetivo.

  12. Fit

    Take your game to the next level with our expert guides, tips and videos for all popular casino games. Bocoran game slot gacor gampang menang terakhir yang wajib untuk anda coba mainkan di situs Slot365 berikutnya adalah Lucky Neko. Lucky Neko ialah game slot online gacor terpopuler yang dikembangkan oleh provider slot terkemuka PG Soft. Memiliki berbagai fitur bonus seperti wild, scatter, dan free spins. Tentunya memungkinkan para penggemarnya untuk mendapatkan keuntungan yang lebih besar selama melakukan taruhan. Casino.org is the world’s leading independent online gaming authority, providing trusted online casino news, guides, reviews and information since 1995. Sorry, an error occurred. Please try again. Please play responsibly. For help, visit mdgamblinghelp.org or call 1.800.GAMBLER.
    https://miloxgqy999628.tribunablog.com/-34240109
    The theft from the Monarch Casino Resort and Spa, located 34 miles west of Denver in Black Hawk, occurred March 12. Casino cashier Sabrina Eddy, 44, has been jailed on suspicion of theft and was still in her cell Tuesday afternoon, according to a Gilpin County Clerk deputy who spoke on the condition her name wouldn’t be used. Funded by investment money from Monarch, the project added a 23- floor hotel, nearly doubling the square footage of the casino and adding 516 rooms, containing guest rooms, restaurants, bars, pools, and spas. Additional information concerning potential factors that could adversely affect all forward-looking statements, including the Company’s financial results, is included in our Securities and Exchange Commission filings, including our most recent annual report on Form 10-K and quarterly reports on Form 10-Q, which are available on our website at monarchcasino.

  13. Medikamente in Belgien leicht kaufenr

    Wow because this is excellent job! Congrats and keep it up. acheter aciclovir sans ordonnance nécessaire

  14. Elisa

    It’s remarkable in support of me to have a site,
    which is good in support of my experience. thanks admin

    Also visit my web site … find here

  15. Denice

    Hi there, i read your blog from time to time
    and i own a similar one and i was just wondering if you get a lot of spam remarks?

    If so how do you protect against it, any plugin or anything you can suggest?
    I get so much lately it’s driving me crazy so any support is very much appreciated.

    Feel free to visit my page … reference; Haley,

  16. LarryOmins

    PBN sites
    We will generate a web of privately-owned blog network sites!

    Pros of our PBN network:

    We execute everything so google does not comprehend that THIS IS A self-owned blog network!!!

    1- We obtain domain names from various registrars

    2- The main site is hosted on a VPS hosting (VPS is fast hosting)

    3- Other sites are on different hostings

    4- We allocate a separate Google ID to each site with verification in Google Search Console.

    5- We create websites on WP, we don’t use plugins with the help of which malware penetrate and through which pages on your websites are produced.

    6- We don’t duplicate templates and employ only distinct text and pictures

    We do not work with website design; the client, if desired, can then edit the websites to suit his wishes

  17. FloydSlusa

    mexican drugstore online: Online Pharmacies in Mexico – buying prescription drugs in mexico online

  18. PedroFug

    buying prescription drugs in mexico: mexican online pharmacies prescription drugs – purple pharmacy mexico price list

دیدگاه خود را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

قبلا حساب کاربری ایجاد کرده اید؟
گذرواژه خود را فراموش کرده اید؟
Loading...
enemad-logo