بررسی ارتباط پلی مورفیسم های پروموتر ژن  GKN1 با خطر ابتلا به سرطان معده

چکیده ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..1

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1-.اپیدمیولوژی سرطان معده……………………………………………………………………………………………………………………………………..2

1-2- معده………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..3

  1-2-1- کاردیا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….4

  1-2-2- طاق و تنه………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..4

  1-2-3- پیلور…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………5

1-3- سلول های موجود در غدد معده……………………………………………………………………………………………………………………………5

  1-3-1- سلول های گردن مخاط………………………………………………………………………………………………………………………………….5

  1-3-2- سلول های تمایز نیافته…………………………………………………………………………………………………………………………………..6

  1-3-3- سلول های اصلی……………………………………………………………………………………………………………………………………………..6

  1-3-4- سلول های کناری یا جداری ………………………………………………………………………………………………………………………….6

  1-3-5- سلول های غدد درون ریز ………………………………………………………………………………………………………………………………7

1-4- انواع سرطان معده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..7

  1-4-1- آدنوکارسینوم نوع روده ای………………………………………………………………………………………………………………………………7

  1-4-2- آدنوکارسینوم نوع منتشر…………………………………………………………………………………………………………………………………8

1-5- اتیولوژی سرطان معده…………………………………………………………………………………………………………………………………………….9

  1-5-1 هلیکوباکتر پیلوری……………………………………………………………………………………………………………………………………………..9

  1 -5-2- رژیم غذایی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………10

  1 -5-3- سیگار……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………10

  1-5-4- فاکتورهای ژنتیکی…………………………………………………………………………………………………………………………………………11

1-6- مخاط معده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….12

1-7- موکوس معده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………12

1-8- پروتئین های گاستروکین …………………………………………………………………………………………………………………………………….13

  1-8-1- ژن GKN1 …………………………………………………………………………………………………………………………………………………….15

  1-8-2-نقش GKN1 در معده و سرطان معده…………………………………………………………………………………………………………..16

1-9- ارتباط پلی مورفیسم‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ ژنتیکی با خطر ابتلا به سرطان…………………………………………………………………………………..18

1-10- اهداف تحقیق…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….20

فصل دوم:پیشینه تحقیق

فصل سوم:مواد و روش ها

3-1- وسایل و مواد مورد استفاده در این مطالعه…………………………………………………………………………………………………………..24

3-2- نوع مطالعه……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..26

3-3- جامعه آماری و نمونه گیری………………………………………………………………………………………………………………… ………………26

3-4- رضایت نامه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….27

3-5- روش تهیه محلول‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ مورد نیاز جهت انجام الکتروفورز……………………………………………………………………………………..27

  3-5-1-روش تهیه بافر الکتروفورز TBE در حجم 500 میلی لیتر……………………………………………………………………………..27

  3-5-2- محلول رنگ آمیزی DNA Stain ………………………………………………………………………………………………………………….28

3-6- استخراج DNA از خون………………………………………………………………………………………………………………………………………….28

3-7- تهیه ژل آگارز و الکتروفورز…………………………………………………………………………………………………………………………………….29

3-8- طراحی پرایمر…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………30

3-9- تکثیر ناحیه پروموتری ژن GKN1……………………………………………………………..………………………………………………………. 31

3-10- توالی یابی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..35

3-11- شناسایی SNPهای پروموتر ژن GKN1 …………………………………………………………………………………………………………….35

3-12- تکنیک  Tetra Primer ARMS- PCR………………………………………………………………………………………………………………..35

3-13- تعیین ژنوتیپ  SNP با شناسه های rs4575760  و rs4072127 با روش Tetra- primer ARMS PCR…………37

3-14- آنالیز آماری………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….42

پرسشنامه………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….43

فصل چهارم-نتایج

4-1- مشخصات جمعیت مورد مطالعه…………………………………………………………………………………………………………………………44

4-2- بررسی ارتباط فاکتورهای خطر با سرطان معده………………………………………………………………………………………………….47

   4-2-1- عفونت هلیکوباکتر پیلوری…………………………………………………………………………………………………………………………..47

  4-2-2- مصرف الکل…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..48

  4-2-3- ازدواج فامیلی والدین……………………………………………………………………………………………………………………………………49

  4-2-4- سابقه سرطان در خانواذه……………………………………………………………………………………………………………………………..51

4-3- بررسی کیفیت DNA استخراج شده…………………………………………………………………………………………………………………..51

4-4- تکثیر ناحیه پروموتری ژن‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ GKN1……………………………………………………………………………………………………………………..52

4-5- شناساییSNP  های ناحیه پروموتری ژن GKN1………………………………………………………………………………………………53

4-6- تعیین ژنوتیپ  SNPبا شناسه‌های rs4575760 وrs4072127  با تکنیک Tetra Primer ARMS- PCR………55

4-7- بررسی ارتباط پلی مورفیسم rs 4575760  ژنGKN1  با خطر ابتلا به سرطان معده……………………………………….58

4-8– بررسی ارتباط پلی مورفیسم rs 4072127 ژن GKN1 با خطر ابتلا به سرطان معده……………………………………….58

4-9- بررسی ارتباط پلی مورفیسم‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ ژنGKN1   با نوع تومور………………………………………………………………………………..60

فصل پنجم-بحث و نتیجه گیری

5-1- عوامل موثر در ابتلا به سرطان معده…………………………………………………………………………………………………………………62

  5-1-1- بررسی نتایج حاصل از اثر عفونت هلیکوباکتر پیلوری بر ابتلا به سرطان معده………………………………………….63

  5-1-2- بررسی نتایج حاصل از تاثیر الکل با خطر ابتلا به سرطان معده…………………………………………………………………63

  5-1-3- سابقه سرطان در خانواده (اقوام درجه یک)……………………………………………………………………………………………….64

5-1-4- نتایج حاصل از بررسی ارتباط پلی مورفیسم‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ تک نوکلئوتیدی پروموتر ژن GKN1 با خطر ابتلا به سرطان

 معده………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………65

پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………67

رفرنس…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….68

چکیده خارجی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….78

فهرست شکل ها

شکل 1-1-قسمت‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ مختلف معده……………………………………………………………………………………………………………………………..4

شکل 1- 2- ترکیبات تشکیل دهنده موکوس……………………………………………………………………………………………………………..12

شکل1 – 3- ساختار فضایی پروتئین های گاستروکین……………………………………………………………………………………………….14

شکل 1-4- بیان GKN_S، TFF_S و موسین‌ها در اپیتلیوم معده موش………………………………………………………………………….14

شکل 1-5- جایگاه ژن‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ GKN1، GKN2 و GKN3 بر روی کروموزوم 2 انسان…………………………………………………..15

شکل 1-6- موقعیت 38CYS در 3 ژنGKN1، GKN2 و GKN3……………………………………………………………………………16

شکل 3-1: نمایی از تکنیک Tetra Primer ARMS- PCR……………………………………………………………………………………….36

شکل 4-1: الکتروفورز DNA استخراج شده بر روی ژل آگارز 1 درصد. …………………………………………………………………..51

شکل 4-2:   تکثیر بخشی از ناحیه پروموتری ژن GKN1 (GKN1A)……………………………………………………………………..52

شکل 4-3: تکثیر بخشی از ناحیه پروموتری ژن GKN1 (GKN1B)………………………………………………………………………..53

              شکل 4-4 : مقایسه توالی ناحیه پروموتر ژن GKN1 با نرم افزار SeqMan ………………………………………………………………54

               شکل 4-5: ژنوتیپ‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ مختلف در SNP  rs 4557760 در پروموتر ژن GKN1………………………………………………………..54

               شکل4-6 :ژنوتیپ‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ مختلف در SNP 72127  rs 40 در پروموتر ژن GKN1 ……………………………………………………….55

               شکل4-7: تعیین ژنوتیپ SNP با شناسه 4557760  rs ژن GKN1 با تکنیک Tetra Primer ARMS- PCR………..56

               شکل4- 8: تعیین ژنوتیپ SNP با شناسه 4072127  rsژن GKN1 با تکنیک  .Tetra Primer ARMS- PCR………57

               شکل 5-1: نواحی پروموتری ژن‌های GKN2، TFF1، TFF2 و TFF3 و فاکتورهای رونویسی مربوط به این ژن‌ها….67

 

فهرست جداول

جدول 1-1– خلاصه ای از پلی مورفیسم‌ها‌یی که با انواع منتشر و روده ای سرطان معده در ارتباط هستند……………19

جدول 3-1- توالی پرایمرهای GKN1A و GKN1B…………………………………………………………………………………………………….32

جدول 3-2- شرایط PCR جهت تکثیر ناحیه پروموتری ژن GKN1 (GKN1A و GKN1B )…………………………………..33

جدول 3-3- میزان مواد مورد نیاز PCR جهت تکثیر ناحیه پروموتری ژن GKN1…………………………………………………….34

جدول 3-5- توالی پرایمرهای مورد استفاده در Tetra- primer ARMS PCR برای تعیین ژنوتیپ rs4575760……..37

جدول 3-6- توالی پرایمرهای مورد استفاده در Tetra- primer ARMS PCR برای تعیین ژنوتیپ rs4072127……..38

جدول 3-7- مواد و حجم مورد نیاز برای انجام Tetra- primer ARMS PCR  برای تعیین ژنوتیپrs 4575760 ……39           جدول 3-8- مواد و حجم مورد نیاز برای انجام Tetra- primer ARMS PCR  برای تعیین ژنوتیپ rs 4072127 ….40          جدول3-9- شرایط PCR برای تعیین ژنوتیپ rs4575760…………………………….. …………………………..41       جدول3-10- شرایط PCR برای تعیین ژنوتیپ rs4072127………………………………………………………………………………………41        جدول4-1: مشخصات نمونه‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های جمعیت A……………………………………………………………………………………………………………….45

جدول4-2: مشخصات نمونه‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ جمعیت B……………………………………………………………………………………………………………….46

جدول 4-3: ژنوتیپ نمونه‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ بیمار و شاهد پلی‌مورفیسم rs 4557760 ………………………………………………………………….59

جدول 4-4: ژنوتیپ نمونه‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ بیمار و شاهد پلی مورفیسم rs 4072127 ………………………………………………………………..59

فهرست نمودارها

نمودار4-1- فراوانی سرطان های Intestinal (19 نفر)و diffuse (12 نفر) در بیماران آلوده به هلیکوباکتر پیلوری در

 جمعیت A……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..47

نمودار 4-2- فراوانی سرطان های Intestinal (17 نفر) و diffuse (11 نفر) در مبتلایان به هلیکوباکتر پیلوریدر

جمعیت B…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….48

نمودار4-3: فراوانی افراد الکلی و غیر الکلی در گروه بیمار و شاهد در جمعیت A……………………………………………………49

نمودار 4-4: فراوانی افراد الکلی و غیر الکلی در گروه بیمار و شاهد در جمعیتB ………………………………………………….49

نمودار 4-5: فراوانی ازدواج فامیلی و غیر فامیلی والدین در گروه بیمار و شاهد جمعیت A……………………………………50

نمودار 4-6: فراوانی ازدواج فامیلی و غیر فامیلی والدین در گروه بیمار و شاهد جمعیت B…………………………………..50