بررسی میزان شیوع پلی مورفیسم CYP3A5*3   در قومیت های مختلف ایرانی

رشته: زیست شناسی- ژنتیک

عنوان:

بررسی میزان شیوع پلی مورفیسم CYP3A5*3   در قومیت های مختلف ایرانی

چکیده:

حذف ترکیبات بیگانه مانند مواد شیمیایی و دارو ها فرایند بسیار مهمی است که آنزیم های سیتوکروم P450  مهمترین خانواده آنزیمی دخیل در این فرایند هستند.

             زیر خانواده A4  و A5 مسئول متابولیز 50% داروهایی است که به صورت رایج استفاده می شوند. پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی می تواند موجب  تغییراتی در بیان و عملکرد آنزیم شوند. وقوع یک SNP در نوکلئوتید موقعیت 6986 در ژن CYP3A5 ،با جای گزینی باز آلی G  به جای A، سبب نقص در فرایند پیرایش متناوب و در نتیجه عدم ساخت پروتئین CYP3A5 می شود .

            از آنجا که پراکندگی این پلی مورفیسم ها در قومیت های مختلف متفاوت است، شناساییSNP  در ژن های مهم متابولیز کننده می تواند نگرش جدیدی در مورد تجویز دارو بر مبنای ژنتیک افراد ایجاد کند.  با توجه به عدم انجام تست ژنتیکی قبل از تجویز دارو، بسیاری از افراد در معرض پیامد های ناشی از عوارض جانبی دارو هستند. تعیین دوز کافی از داروی کارآمد، با صرف هزینه بسیار کمتری جهت تعیین ژنوتیپ افراد می تواند ارتقاء سلامت جامعه را به همراه داشته باشد.

          در این مطالعه با تعیین ژنوتیپ افراد در جامعه آماری 300 نفری توسط روشPCR-RFLP، شیوع این الل در جمعیت ایرانی و در بین 4 قومیت فارس، ترک، لر و کرد بررسی گردید. فراوانی الل G در کل جمعیت ایرانی 94%  تعیین شد.در بین 4 قومیت یاد شده تفاوت محسوسی در فراوانی الل G مشاهده نشد. فراوانی افراد متابولیز کننده ضعیف89% و فراوانی افراد متابولیز کننده طبیعی11% تعیین شد. بنا بر این نتایج، ریسک سمیت دارویی برای افراد استفاده کننده از از دارو های مسکن و آرام بخش، داروهای سرکوب کننده سیستم ایمنی و داروهای کاهش دهنده چربی خون بالاست .

            واژگان کلیدی:Cytochrome P450, Polymorphism ,SNP

فهرست مطالب

         مقدمه………………………………………………………………………………………………1

   فصل اول: کلیات تحقیق

1-1- فارماکولوژی……………………………………………………………………………………………………………………3

1-1-1- فارماکوژنتیک………………………………………………………………………………………………………………3

1-1-2- پزشکی شخصی شده……………………………………………………………………………………………………5

1-2- سیتوکروم  P450……………………………………………………………………………………………………………..6

1-2-1- معرفی………………………………………………………………………………………………………………………..6

1-2-2- جایگاه سیتوکروم P450 در مطالعات فارماکوژنتیکی…………………………………………………………7

1-2-3- تاریخچه تکاملی………………………………………………………………………………………………………….9

1-2-4- نحوه نام گذاری…………………………………………………………………………………………………………10

1-2-5- سیتوکروم P450 در سایر موجودات……………………………………………………………………………..10

1-2-6- سیتوکروم P450  بر حسب مکان یابی در سلول…………………………………………………………….11

1-2-7- توزیع سیتوکروم های P450 در اندام های مختلف…………………………………………………………12

1-3- سیتوکروم P450 زیر خانواده A (CYP3A)………………………………………………………………………13

1-4- ساختار ژن CYP3A5…………………………………………………………………………………………………….17

1-5- عوامل موثر روی تغییر بیان ژن های سیتوکروم P450  ………………………………………………………..18

1-5-1- پلی مورفیسم…………………………………………………………………………………………………………….18

1-5-2- تاثیرات اپی ژنتیکی)  روی متابولیسم دارو(……………………………………………………………………20

1-5-3- فاکتور های غیر ژنتیکی میزبان…………………………………………………………………………………….21

1-5-4- قومیت و نژاد…………………………………………………………………………………………………………….22

1-6- مزایای استفاده از SNP در آنالیز های ژنتیکی…………………………………………………………………… 22

1-6-1- فراوانی…………………………………………………………………………………………………………………… .22

1-6-2- مکان………………………………………………………………………………………………………………………..23

1-6-3- منشا و الگوهای هاپلوتایپی………………………………………………………………………………………….23

1-6-4- سهولت در تعیین ژنوتیپ……………………………………………………………………………………………23

1-6-5- فرکانس اللی پایین تر…………………………………………………………………………………………………23

1-6-6- جهش زایی کمتر……………………………………………………………………………………………………….24

1-6-7- اطلاعات جدید………………………………………………………………………………………………………….24

1-7- اثرات کلی پلی مورفیسم در ژن های سیتوکروم P450………………………………………………………..24

1-8- سایر عوامل موثر روی فعالیت ژن های سیتوکروم……………………………………………………………..26

1-9- پلی مورفیسم ژنتیکی    CYP3A5*3……………………………………………………………………………….26

1-10- متابولیسم دارویی CYP3A5………………………………………………………………………………………….27

1-11- سوبستراهای دارویی A5  …………………………………………………………………………………………….30

1-12- تداخلات دارویی با آنزیم های CYP……………………………………………………………………………. 31

1-13- تداخلات مواد غیر دارویی با آنزیم های سیتوکروم P450………………………………………………….32

1-14- کاربرد های کلینیکی پلی مورفیسم CYP3A5………………………………………………………………….33

1-14-1- فشار خون………………………………………………………………………………………………………………33

1-14-2- سرطان……………………………………………………………………………………………………………………34

1-14-3- سل…………………………………………………………………………………………………………………………34

1-14-4- اختلالات روانی……………………………………………………………………………………………………….35

1-14-5- انسداد مزمن ریوی…………………………………………………………………………………………………..35

1-14-6- صرع………………………………………………………………………………………………………………………36

1-15- طبقه بندی آنزیم های CYP بر حسب طبیعت انتقال الکترون…………………………………………….36

1-16- ساختار کلی آنزیم های سیتوکروم P450…………………………………………………………………………37

1-17- مکانیسم کاتالیتیکی آنزیم های سیتوکروم P450……………………………………………………………….38

1-18- اهداف……………………………………………………………………………………………………………………….41

   فصل دوم:مبانی نظری و پیشینه تحقیق

2-1- مروری بر تاریخچه سیتوکروم P450………………………………………………………………………………..44

2-1-1- تاریخچه کشف و نام گذاری……………………………………………………………………………………….44

2-1-2- مطالعات اخیر……………………………………………………………………………………………………………46

   فصل سوم:روش تحقیق

3-1- جمع‌آوري نمونه……………………………………………………………………………………………………………51

3-2- وسایل و دستگاه های مورد نیاز……………………………………………………………………………………….51

3-2-1- دستگاه ها و وسايل مورد نياز در استخراج …………………………………………………………………..51

3-2-2- دستگاه ها و وسايل مورد نياز برای انجام واکنش PCR…………………………………………………..51

3-3-2- دستگاه ها و وسايل مورد نياز برای الکتروفورز روی ژل آگارز…………………………………………52

٣-2-4- دستگاه ها و وسايل مورد نياز برای الکتروفورز روی ژل پلی آکریل آمید…………………………..53

3-3- مواد شیمیایی استفاده شده……………………………………………………………………………………………….53

3-3- 1- مواد شیمیایی مورد نياز در استخراج DNA…………………………………………………………………..53

3-3-2- مواد شیمیایی مورد نياز برای تهیه ژل آگارز…………………………………………………………………..53

3-3-3- مواد شیمیایی مورد نياز برای انجام واکنش PCR……………………………………………………………54

٣-3-5- مواد شیمیایی مورد نياز برای برش آنزیمی…………………………………………………………………….54

٣-3-6- مواد شیمیایی مورد نياز برای تهیه ژل پلی آکریل آمید…………………………………………………….54

٣-3-7- مواد شیمیایی مورد نياز برای رنگ آمیزی ژل پلی آکریل آمید………………………………………….55

3-4- دستورالعمل تهیه بافرها و محلول های مورد نیاز……………………………………………………………….55

3-4-1- محلول های لازم برای تهیه ژل آگارز و انجام الکتروفورز افقی……………………………………….56

3-4-2- محلول های لازم برای تهیه ژل پلی آکریل آمید و انجام الکتروفورزعمودی………………………56

3-4-3- محلول های لازم جهت رنگ آمیزی نیترات نقره ژل پلی آکریل آمید……………………………….56

3-5- روش انجام کار…………………………………………………………………………………………………………….57

3-5-1- استخراج DNA با استفاده از کیت ژن پژوهان پویا………………………………………………………. 57

3-5-2- تعیین غلظت DNA استخراج شده………………………………………………………………………………59

3-6- الکتروفورز DNA روی ژل آگارز……………………………………………………………………………………60

3-6-1- الکتروفورز DNA روی ژل آگارز به منظور بررسی کیفی محصول PCR………………………….61

3-6-2- دستورالعمل تهیه ژل آگارز 5/1%   ……………………………………………………………………………….61

3-7- PCR…………………………………………………………………………………………………………………………..62

3-7-1- مراحل یک سیکل PCR   ……………………………………………………………………………………………64

3-7-2- پارامترهای موثر در PCR…………………………………………………………………………………………..65

3–73- نکات مربوط به تک تک مواد موثردر واکنشPCR   ……………………………………………………….65

3-7-4- بهینه سازی مواد مورد استفاده در PCR………………………………………………………………………..70

3-7-5- برنامه حرارتی PCR………………………………………………………………………………………………….71

3-8- RFLP…………………………………………………………………………………………………………………………72

3-8-1- تاریخچه RFLP……………………………………………………………………………………………………….73

3-8-2- مزایای RFLP………………………………………………………………………………………………………….73

3-9- هضم آنزیمی……………………………………………………………………………………………………………….73

3-10- ژل پلی آکریل آمید………………………………………………………………………………………………………74

3-10-1- الكتروفورز با ژل پلي آكريل آميد………………………………………………………………………………75

3-10-2- دستورالعمل تهیه ژل پلي آكريل آميد8%……………………………………………………………………..76

3-10-3- رنگ آمیزی ژل پلی آکریل آمید با نیترات نقره…………………………………………………………….78

3-11- نحوه انجام آنالیز آماری………………………………………………………………………………………………..79

   فصل چهارم:یافته های تحقیق

4-1- استخراج DNA……………………………………………………………………………………………………………..81

4-2-  PCR…………………………………………………………………………………………………………………………..82

4-3- RFLP………………………………………………………………………………………………………………………….83

4-4- نتایج حاصل از آنالیز آماری…………………………………………………………………………………………….85

4-4-1- آنالیز آماری بین قومیت های مختلف ایرانی…………………………………………………………………..85

4-4-2- مقایسه فراوانی اللی در قومیت های مختلف ایرانی……………………………………………………….. 88

4-4-3- مقایسه فراوانی الل G در بین زنان و مردان ایرانی…………………………………………………………..88

4-4-4- اطلاعات آماری در کل جمعیت ایرانی………………………………………………………………………….89

4-4-4-1- فراوانی ژنوتیپی در جمعیت ایرانی……………………………………………………………………………89

4-4-4-2- فراوانی اللی  در جمعیت ایرانی……………………………………………………………………………….90

4-4-4-3- توزیع فنوتیپی به لحاظ توانایی متابولیز سوبسترا در جمعیت ایرانی………………………………91

4-4-5- آنالیز آماری اطلاعات به دست آمده در جمعیت ایرانی توسط نرم افزار Popgene……………..91

   فصل پنجم:نتایج و پیشنهادات

5-1- نگاه اجمالی بر مفاهیم مطرح شده……………………………………………………………………………………93

5-2-  تعادل هاردی- واینبرگ…………………………………………………………………………………………………94

5-2-1- عوامل مؤثر در برقرار ماندن تعادل هاردی-  واينبرگ………………………………………………………94

5-2-2- عواملی که تعادل را به هم می زنند………………………………………………………………………………94

5-3- نتایج فارماکوژنتیکی حاصل از شیوع پلی مورفیسم CYP3A5*3 در ایران…………………………….96

5-4- مقایسه فراوانی پلی مورفیسم CYP3A5*3  در ایران و سایر نقاط جهان………………………………97     

پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………………100

پیوست1- نتایج به دست آمده از آنالیز آماری توسط نرم افزار Pop gene…………………………………….102

فهرست منابع……………………………………………………………………………………………………………………….108

فهرست اشکال

شکل 1-1: خانواده آنزیمی سیتوکروم P450 برحسب سهم اجزای تشکیل دهنده این خانواده……………7

شکل 1-2: نحوه قرارگیری ژن های خانواده A روی کروموزوم 7………………………………………………..14

شکل 1-3:القای ژن  CYP3A با اثردارو بر عناصر پاسخ دهنده PXR………………………………………….16

شکل 1-4 :نمایی شماتیک از ژن CYP3A5……………………………………………………………………………..18

شکل 1-5 : نمایی کلی از ساختار آنزیم های سیتوکروم P450…………………………………………………….38

شکل 1-6: شمایی از مراحل کاتالیتیک آنزیم های سیتوکروم P450 …………………………………………….41

 شکل3-1: روش الکتروفورز………………………………………………………………………………………………….59

شکل 3-2: دستگاه اسپكتروفتومتر……………………………………………………………………………………………60

شکل3-3: چگونگی تکثیر ژنوم در روش PCR………………………………………………………………………..63

شکل 3-4: مشخصات مربوط به طول و توالی تکثیر شده با استفاده از سایت UCSC …………………..67

 شکل 3-5: سایت برش آنزیم SspI……………………………………………………………………………………….74

شکل 3-6: تانک الکتروفورز عمودی………………………………………………………………………………76

شکل 3-7: موقعیت اجزای مختلف الکتروفورز عمودی و ژل……………………………………………….78

شکل 4-1: کیفیت DNA استخراج شده روی ژل آگارز 5/1……………………………………………………..81

شکل 4-2: محصول PCR ران شده روی ژل آگارز ……………………………………………………..82

شکل 4-3: نواحی برش آنزیم های محدودالاثر مختلف روی محصول .PCR   ………………………..83

شکل 4-4: الکتروفورز روی ژل پلی آکریل آمید (1)…………………………………………………………..84

شکل 4-5: الکتروفورز روی ژل پلی آکریل آمید (2)…………………………………………………………..85

  شکل5-1: رابطه فرکانس الل A5*3 با افزایش عرض جغرافیایی عرض 0˚ خط استوا……………99

فهرست جداول

جدول 1-1: داروهایی که توسط آنزیم CYP3A5 متابولیز می شوند……………………………………………..30

جدول 1-2: بازدارنده ها و القاکننده های بیان .CYP3A5…………………………………………………………..31

جدول 2-1:فرکانس الل3 ژن A5 به تفکیک رنگ پوست در برزیل…………………………………………….48.

 جدول 3-1: مواد لازم PCR ژن  CYP3A5 برای یک ویال………………………………………………………69

 جدول 3-2: بهینه سازی PCR ژن  CYP3A5 ………………………………………………………………………70

 جدول 3-3: غلظت نهایی مواد  PCR ژن  CYP3A5 …………………………………………………………….71

 جدول3-4: برنامه حرارتي PCR براي ژن CYP3A5 ……………………………………………………………..71

 جدول3-5: مواد لازم برای هضم آنزیمی محصول PCR ………………………………………………………….74

 جدول3-6: غلظت های مناسب ژل آگارز و ژل پلی آکریل آمید جهت تفکیک قطعات DNA…….75..

 جدول3-7: مواد لازم برای تهیه ژل پلی آکریل آمید 8% …………………………………………………………..77    جدول 4-1: توزیع ژنوتیپی در جامعه آماری مطالعه شده………………………………………………………….89

جدول 5-1: فراوانی اللG در نقاط مختلف جهان…………………………………………………………………….97

فهرست نمودارها

نمودار4-1: فراوانی ژنوتیپی در قومیت فارس…………………………………………………………………………..86

نمودار4-2: فراوانی ژنوتیپی در قومیت کرد………………………………………………………………………………86

نمودار4-3:فراوانی ژنوتیپی در قومیت ترک……………………………………………………………………………..87

نمودار4-4: فراوانی ژنوتیپی در قومیت لر………………………………………………………………………………..87

نمودار4-5:فراوانی الل A و G در هر یک از قومیت های ایرانی…………………………………………………88

نمودار4-6: فراوانی الل های A و G در بین زنان و مردان در جمعیت ایرانی……………………………….89

نمودار 4-7: توزیع ژنوتیپی CYP3A5*3 در جمعیت ایرانی……………………………………………………..90

نمودار4-8: فراوانی الل A  و G در جمعیت ایرانی…………………………………………………………………..90

نمودار 4-9: توزیع فنوتیپی انواع متابولیزکننده های سوبستراهایCYP3A5*3. ……………………………91