مطالعه تاثیر اگزالی- پالادیوم بر فعالیت و ساختار آنزیم کاتالاز کبد گاو

عنوان                                                                                                                                                       صفحه

1– مقدمه …………………………………………………………………………………………………. 1

1-1- استرس اکسیداتیو ……………………………………………………………………………………… 1

1-2-کاتالاز………………………………………………………………………………………………….. 3

1-2-1- تاریخچه کاتالازها…………………………………………………………………………………. 3

1-2-2- تنوع کاتالازها……………………………………………………………………………………… 5

1-2-3- بیولوژی مولکولی و ژنتیک کاتالاز………………………………………………………………. 8

1-2-4- خصوصیات ساختاری کاتالازهای حقیقی………………………………………………………… 9

1-2-5- NADPH به عنوان کوفاکتور کاتالاز……………………………………………………………. 19

1-2-6- مکانیسم عمل کاتالاز……………………………………………………………………………… 21

1-2-7- مهارکننده های کاتالاز……………………………………………………………………………. 25

1-2-8- آکاتالازمیا و هیپوکاتالازمیا………………………………………………………………………. 26

1-2-9- فراوانی و اهمیت زیستی کاتالاز……………………………………………………………………. 27

1-2-10- کاتالاز و سرطان………………………………………………………………………………….. 28

1-3- کمپلکس های ضدسرطان پلاتین و پالادیوم…………………………………………………………… 30

1-3-1- مکانیسم عمل داروهای پلاتینی……………………………………………………………………… 32

1-4- هدف از پایان نامه……………………………………………………………………………………… 33

2- مواد و روشها……………………………………………………………………….. 36

2-1- مواد……………………………………………………………………………………………………… 36

2-2- آماده سازی محلول ها………………………………………………………………………………….. 36

2-2-1- تهیه بافر……………………………………………………………………………………………… 36

2-2-2- تهیه محلول کاتالاز………………………………………………………………………………….. 37

2-2-3- تهیه محلول اگزالی- پالادیوم………………………………………………………………………… 37

2-3- روشها…………………………………………………………………………………………………… 38

2-3-1- مطالعات اسپکتروسکوپی…………………………………………………………………………… 38

2-3-2- مطالعات ساختاری………………………………………………………………………………….. 40

3- نتایج و یافته ها……………………………………………………………………… 44

3-1- مقایسه توالی کاتالاز کبد گاو وانسان………………………………………………………………….. 44

3-2- مطالعات سینتیکی………………………………………………………………………………………. 45

3-2-1- سنجش فعالیت آنزیم…………………………………………………………………………………. 45

3-2-2- بررسی تاثیر اگزالی- پالادیوم بر فعالیت کاتالاز………………………………………………….. 49

3-2-3- تعیین نوع مکانیسم مهار کاتالاز توسط اگزالی- پالادیوم………………………………………….. 51

3-3- مطالعات ساختاری……………………………………………………………………………………… 55

3 -3-1- مطالعات فلوئورسانس……………………………………………………………………………… 55

3-3-1- ثابت اتصال کاتالاز به اگزالی – پالادیوم و تعداد جایگاه های اتصال……………………………. 62

3-3-2- پارامترهای ترمودینامیکی و نوع نیروهای پیوندی……………………………………………….. 64

3-3- مطالعات  دورنگ نمایی دورانی………………………………………………………………………. 65

3-4- مطالعات طیف سنجی مرئی- ماوراء بنفش کاتالاز در حضور اگزالی- پالادیوم…………………… 70

4- بحث و نتیجه گیری………………………………………………………………… 75

4-1-  انواع مهار آنزیمی و مقایسه آنها……………………………………………………………………… 75

4-2-  تاثیر انواع داروهای ضدسرطان بر فعالیت کاتالاز کبد…………………………………………….. 77

4-3- اثر اگزالی- پالادیوم بر فعالیت کاتالاز و بررسی نوع مکانیسم مهار آن……………………………. 79

4-4- تغییر در ساختمان سه بعدی کاتالاز در حضور اگزالی- پالادیوم……………………………………. 81

4-4-1- گزینه های احتمالی در کاتالاز برای اتصال به اگزالی- پالادیوم…………………………………. 83

4-5- تغییرات در ساختار ثانویه آنزیم کاتالاز در حضور اگزالی- پالادیوم………………………………. 85

4-6- تغییر در ساختار هِم کاتالاز در حضور اگزالی- پالادیوم……………………………………………. 86

4-7- اهمیت تغییر در فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانت در طی شیمی درمانی…………………………….. 87

4-8- نتیجه گیری کلی………………………………………………………………………………………… 90

4-9- پیشنهادات……………………………………………………………………………………………….. 91

فهرست جداول

عنوان                                                                                                                                                       صفحه

جدول 1-1- مقایسه ساختمان کلی و اندازه کاتالازهای حاوی هِم با زیرواحد کوچک، زیرواحد بزرگ، کاتالاز- پراکسیداز و منگنزکاتالاز             8

جدول 3-1- مقادیر پارامترهای سینتیکی آنزیم در حضور غلظت های مختلف اگزالی- پالادیوم در دمای 25 درجه سانتیگراد 51

جدول 3-2-  پارامترهای ترمودینامیکی و اتصالی اگزالی- پالادیوم به BLC در دماهای 25 و 37 درجه سانتیگراد  65

جدول 3-3- تغییرات محتوای ساختار دوم آنزیم کاتالاز در غیاب و حضور غلظت های مختلف اگزالی پالادیوم در دمای 25 درجه سانتیگراد…………………………………………………………………………………………………………………. 66

جدول 3-4- تغییرات محتوای ساختار دوم آنزیم کاتالاز در غیاب و حضور غلظت های مختلف اگزالی پالادیوم در دمای 37 درجه سانتیگراد…………………………………………………………………………………………………………………. 66

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                                                                       صفحه

شکل 1-1- مسیرهای حذف H₂O₂ در اریتروسیت توسط کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز…………………. 2

شکل 1-2- تجمع 4 زیرواحد با تقارن D₂ . چهار زیرواحد کاتالاز نیز وضعیتی مشابه دارند……………. 9

شکل 1-3-  نمایش یک زیرواحد از کاتالاز کبد گاو: گروه هِم نیز در مرکز آنزیم مشخص است……….. 13

شکل 1-4-  نمایش ساختار تترامر آنزیم کاتالاز کبد گاو رسم شده توسط نرم افزار    Swiss- Pdb Viewere 3.7 14

شکل 1- 5-  جایگاه فعال هِم در یک مونور کاتالاز……………………………………………………….. 16

شکل 1- 6- کانال هیدروفوبی و جایگاه فعال هِم در انتهای این کانال……………………………………… 18

شکل 1-7-  جایگاه اتصال NADPH بر کاتالازانسانی………………………………………………….. 20

شکل 1-8-  سیس پلاتین و مشتقات آن………………………………………………………………………. 32

شکل 1-9- مسیر تشکیل کراس لینک درون رشته ای GG و AG در DNA توسط سیس پلاتین…………. 33

شکل 3-1- مقایسه توالی کاتالاز کبد گاو با کاتالاز انسانی…………………………………………………. 45

شکل 3-2- نمودار میکائیلیس- منتن آنزیم کاتالاز کبد گاو در حضور غلظت های مختلف هیدروژن پراکسید در دمای 25 درجه سانتیگراد                      47

شکل 3-3- نمودار لاینویور- برک (1/V بر حسب 1/[S] ( آنزیم کاتالاز در دمای 25 درجه سانتیگراد.. 48

شکل 3-4- نمودار فعالیت کاتالاز در برابر غلظت های مختلف اگزالی- پالادیوم بر حسب میکرومولار در دمای 25 درجه سانتیگراد   50

شکل 3-5- نمودار لاینویور- برک کاتالاز در حضور غلظت های صفر،  ½ IC₅₀ ، IC₅₀ و 2IC₅₀  از اگزالی- پالادیوم در دمای 25 درجه سانتیگراد……………………………………………………………………………………………………… 53

شکل 3-6- نمودار ثانویه،  بر حسب غلظتهای مختلف  اگزالی- پالادیوم……………………………. 54

شکل 3-7- طیف نشری کاتالاز کبد گاو در غیاب و در حضور غلظت های مختلف میکرومولار اگزالی- پالادیوم در دمای 25 درجه سانتیگراد……………………………………………………………………………………………………… 56

شکل 3-8-  طیف نشری کاتالاز کبد گاو در غیاب و در حضور غلظت های میکرومولار اگزالی- پالادیوم  در دمای 37 درجه سانتیگراد………………………………………………………………………………………………………………… 57

شکل 3-9- نمودارتغییرات در نشر بیشینه کاتالاز در برابر غلظت های مختلف اگزالی – پالادیوم (µM )  در دمای 25 درجه سانتیگراد  و دمای 37 درجه سانتیگراد……………………………………………………………………………………. 58

شکل 3-10 – نمودار استرن – ولمر  آنزیم کاتالاز در دماهای در دمای 25 درجه سانتیگرادو دمای 37 درجه

 سانتیگراد…………………………………………………………………………………………………….. 61

شکل 3-11- نمودار خطی log[F₀ – F/F] در مقابل log[Q] در دماهای 25 و  37 درجه ی سانتیگرد. 63

شکل 3-12- منحنی های CD ناحیه دور کاتالاز در دمای 25 درجه سانتیگراد…………………………… 68

شکل 3-13- منحنی های CD ناحیه دور کاتالاز در دمای 37 درجه سانتیگراد…………………………… 69

شکل 3-14- تغییرات در طیف جذبی آنزیم کاتالاز  درحضوربا غلظت های افزایشی اگزالی پالادیوم  در دمای 25 درجه سانتیگراد     71

شکل 3-15-  نمودار تغییرات جذب در طول موج 280 نانومتر آنزیم کاتالاز  بر حسب غلظت های مختلف  اگزالی- پالادیوم در دمای 25 درجه سانتیگراد……………………………………………………………………………………………….. 72

شکل 3- 16- نمودار جذب در طول موج 405 نانومترکاتالاز در برابر غلظت اگزالی- پالادیوم در دمای 25 درجه سانتیگراد            73

شکل 4-1- ساختمان شیمیایی اگزالی- پالادیوم………………………………………………………………. 78

شکل 4-2- شمای مکانیسم مهار غیر رقابتی………………………………………………………………… 79