فهرست مطالب
عنوان |
صفحه |
فصل اول: مقدمه |
|
1-1- آنزیمها |
2 |
1-2- لیپازها |
3 |
1-2-1- ارتباط ساختار آنزیم لیپاز با عملکرد آن |
5 |
1-3- آنزیمها در محیط آلی |
6 |
1-4- مایعات یونی |
8 |
1-5- بیوکاتالیز در مایعات یونی |
9 |
1-5-1- آنزیمها در مخلوطهای مایع یونی – آب |
10 |
1-5-2- فعالیت آنزیمها در شرایط نسبتا بیآب در مایعات یونی |
11 |
1-5-3- پایداری آنزیمها در مایعات یونی تقریبا بیآب |
13 |
1-5-4- آنزیمها، مایعات یونی، پیوندهای هیدروژنی و فعالیت |
13 |
1-5-5- بیوترانسفورماسیون در محیط مایعات یونی توسط لیپازها و استرازها |
14 |
1-6- بررسی ساختار پروتئین به روش اسپکتروسکوپی فلورسانس |
15 |
فصل دوم: مروری بر پژوهشهای پیشین |
|
2-1- پیشینه کاربرد مایعات یونی در بیوکاتالیز |
18 |
2-2- اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم |
19 |
2-3- بررسی ساختار آنزیمها در مایعات یونی |
22 |
اهداف |
23 |
فرضیه |
23 |
فصل سوم: مواد و روشها |
|
3-1- ابزار |
25 |
عنوان |
صفحه |
3-2- مواد |
26 |
3-2-1- مواد لازم جهت تهیه مایعات یونی |
26 |
3-2-2- مواد لازم جهت تهیه آنزیم لیپاز درون سلولی TTL |
26 |
3-2-2-1- سوش باکتری |
26 |
3-2-2-2- مواد مورد نیاز برای ترانسفورماسیون |
26 |
3-2-2-3- مواد مورد نیاز برای کشت باکتری و استخراج عصاره سلولی |
26 |
3-2-2-4- مواد مورد نیاز برای تخلیص آنزیم لیپاز |
26 |
3-2-2-5- مواد مورد نیاز برای سنجش کمی میزان پروتئین و ژل SDS PAGE |
27 |
3-2-3- مواد مورد نیاز برای سنجش فعالیت آنزیمی لیپاز |
27 |
3-2-4- نرم افزارها |
27 |
3-3- روشها |
28 |
3-3-1- روش تهیه مایعات یونی |
28 |
3-3-1-1- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید |
28 |
3-3-1-2- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات |
28 |
3-3-2- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب |
29 |
3-3-2-1- محیط کشت باکتری E. coli |
29 |
3-3-2-2- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli |
29 |
3-3-2-2-1- تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی |
29 |
3-3-2-2-2- انتقال پلاسمید به سلول مستعد |
30 |
3-3-2-3- روش تهیه استوک باکتری |
31 |
3-3-2-4- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب |
31 |
3-3-2-5- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب |
31 |
3-3-2-5- 1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL |
31 |
3-3-2-5-2- انتخاب بهترین زمان پس از القا |
32 |
3-3-2-6- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL |
32 |
3-3-3- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL |
33 |
3-3-3-1- روش رسوب دهی دمایی |
33 |
3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی |
33 |
3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی |
33 |
3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین |
34 |
3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد |
34 |
3-3-4-2- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280 |
34 |
عنوان |
صفحه |
3-3-5- الکتروفورز ژل پلیآکریل آمید با SDS (SDS-PAGE) |
35 |
3-3-5-1- آماده سازی محلولهای الکتروفور |
35 |
3-3-5-2- آماده سازی سیستم الکتروفورز |
36 |
3-3-6- سنجش فعالیت آنزیمی با سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات |
38 |
3-3-7- روش بررسی فعالیت آنزیمی در حضور غلظت های مختلف از انواع مایعات یونی |
39 |
3-3-8- روش بررسی پایداری دمایی آنزیم TTL در دماهای بالا |
39 |
3-3-9- روش بررسی پایداری آنزیم لیپاز TTL در حضور مایعات یونی مختلف |
39 |
3-3-10- روش بررسی ساختار سوم آنزیم TTL در حضور مایعات یونی |
40 |
فصل چهارم: نتایج |
|
4-1- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب |
42 |
4-1-1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL |
43 |
4-1-2- بهینه سازی زمان پس از القا |
43 |
4-2- تخلیص آنزیم لیپاز TTL |
44 |
4-2-1- بهینه سازی تخلیص نسبی به روش رسوب دهی دمایی |
44 |
4-2-2- تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی Q- سفاروز |
45 |
4-3- سنتز مایعات یونی |
47 |
4-4- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL |
47 |
4-5- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL |
48 |
4-5-1- پایداری دمایی TTL در عدم حضور مایعات یونی |
48 |
4-5-2- پایداری دمایی آنزیم TTL در حضور مایعات یونی |
49 |
4-5-2-1- بررسی پایداری TTL در [C4MIM][Br] و ] [C4MIM][PF6 در دماهای مختلف |
49 |
4-5-2-2- مقایسه اثر نوع آنیون مایعات یونی بر پایداری دمایی |
51 |
4-5-2-3- مقایسه اثر نوع کاتیون و طولهای مختلف زنجیره کربنی مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم |
51 |
4-6- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور و عدم حضور مایعات یونی |
54 |
فصل پنجم: بحث |
|
5-1- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL |
57 |
عنوان |
صفحه |
5-2- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL |
59 |
5-3- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور مایعات یونی |
61 |
فصل ششم: نتیجهگیری و پیشنهادات |
|
6-1- نتیجهگیری |
63 |
6-2- پیشنهادات |
63 |
فهرست منابع |
65 |
چکیده انگلیسی |
75 |
فهرست جدولها
عنوان |
صفحه |
جدول1-1- میکروارگانیسمهای تولید کننده لیپاز |
4 |
جدول2-1- آنیونهای متداول در مایعات یونی |
19 |
جدول 3-1- محیط کشت Luria Bertani |
29 |
جدول 3-2- نحوه تهیه محلول TSB |
30 |
جدول 3-3- نحوه تهیه محلول KCM |
31 |
جدول 3-4- نحوه تهیه محلول برادفورد |
34 |
جدول 3-5- نحوه تهیه بافر نمونه 4X |
37 |
جدول 3-6- نحوه تهیه ژل پلی اکریل آمید |
37 |
جدول 3-7- نحوه تهیه مخلوط سنجش فعالیت آنزیم |
38 |
جدول 4-1- فعالیتهای لیپازی عصارههای سلولی کلنیهای 1 تا 6 حاصل از ترانسفورماسیون |
44 |
جدول 4-2- مشخصات مراحل تخلیص TTL. |
46 |
جدول 5-1- غلظتهای بهینه مایعات یونی (CnMIM Br n=2,4,6) و CMC های مربوطه |
58 |
فهرست شکلها
عنوان |
صفحه |
شکل 1-1- آنزیم لیپاز ریزوموکور میهی (PDB entry 3TGL) |
6 |
شکل 1-2- آنیونها و کاتیونهای مرسوم در مایعات یونی مورد استفاده در بیوکاتالیز |
9 |
شکل 1-3- آنزیم CALB در حضور مایعات یونی بدون آب |
12 |
شکل2-1- ساختارهای نمونه از کاتیون مایعات یونی معمول در بیوکاتالیز |
18 |
شکل 3-1- سنتز مایعات یونی با آنیون برمید |
28 |
شکل 4-1- وکتور PQE-80L حاوی ژن آنزیم TTL |
42 |
شکل 4-2- بهینه سازی مدت زمان تخلیص به روش رسوب دهی دمایی |
45 |
شکل 4-3- کروماتوگرام ستون Q- سفاروز؛ تخلیص آنزیم TTL |
46 |
شکل 4-4- تصویر ژل SDS-PAGE 5/12 % از مراحل تخلیص آنزیم TTL |
47 |
شکل 4-5- اثر غلظتهای مختلف مایعات یونی بر فعالیت آنزیمی |
48 |
شکل 4-6- نمودار پایداری آنزیم TTL در دماهای بالا در بافر تریس mM 50 |
49 |
شکل4-7- نمودار پایداری TTL در [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] در دماهای °C 85 و °C90 |
50 |
شکل4-8- نمودار پایداری دمایی TTL در مایعات یونی؛ مقایسه اثر نوع آنیون |
52 |
شکل 4-9- نمودار مقایسه اثر مایعات یونی با طولهای مختلف زنجیره کربنی کاتیون ایمیدازولیوم بر پایداری دمایی آنزیم TTL |
53 |
شکل 4-10- نمودار بررسی اثر نوع کاتیون بر پایداری دمایی آنزیم TTL |
53 |
شکل 4-11- طیف فلورسانس آنزیم TTL در بافر تریس mM 50 پس از حرارتدهی در °C 85 |
54 |
شکل 4-12- طیفهای فلورسانس مربوط به آنزیم TTL انکوبه شده در مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون PF6 |
55 |
شکل 4-13- طیف فلورسانس آنزیم TTL انکوبه شده در مایع یونی [C4MIM][PF6] |
55 |
