مطالعه­ی پلی­مرفیسم و فیلوژنتیک انگل دیکروسلیوم دندریتیکم در ایران بر اساس نواحی ژنیNADH dehydrogenase subunit 1(ND1) وInternal transcribed spacer 2 (ITS-2)  در گوسفند و گاو

فهرست مطالب

عنوان                                         صفحه

فصل اول: مقدمه ………………………….. 2

فصل دوم: کلیات

1-2- برخی خصوصیات ریخت­شناسی خانواده­ی دیکروسلیئیده  6

2-2- دیکروسلیوم و طبقه­بندی آن……………. 7

3-2- گونه­های مهم دیکروسلیوم در نشخواركنندگان. 7

1-3-2- دیکروسلیوم دندریتیکم…………….. 7

2-3-2- دیکروسلیوم هاسپس………………… 9

3-3-2- دیکروسلیوم چایننسیس…………….. 10

4-3–2- دیکروسلیوم ارینتالیس (سوپرری)……. 11

4-2- سیر تکاملی ……………………….. 12

5-2- اپیدمیولوژی……………………….. 16

1-5-2- فاکتورهای محیطی………………… 16

2-5-2- حضور میزبان­های واسط…………….. 17

3-5-2- حضور میزبان­های نهائی……………. 18

6-2- نگاهی به پراکندگی انگل در ایران …….. 19

7-2- روش­های انتقال……………………… 23

 

عنوان                                         صفحه

8-2- بیماری­زائی………………………… 24

9-2- علائم بالینی……………………….. 26

10-2- ایمنی در دیکروسلیازیس……………… 27

11-2- جراحات کالبد­گشائی دیکروسلیازیس……… 27

1-11-2- جراحات ماکروسکوپیک…………….. 27

2-11-2- جراحات میکروسکوپیک…………….. 28

12-2- تشخیص……………………………. 28

1-12-2- آزمایش مدفوع………………….. 28

2-12-2- کالبدگشائی……………………. 30

3-12-2- روش­های ایمونولوژیک…………….. 30

4-12-2- تمایز ظاهری…………………… 34

5-12-2- روش­های ایزوآنزیم فوکوسینگ………. 35

6-12-2- پارامتر­های بیوشیمیایی و آنزیم­های کبدی… 38

7-12-2- روش­های مولکولی………………… 39

13-2- کاربرد و ویژگی­های واکنش زنجیره­ای پلیمراز 40

14-2- اصول کلی PCR……………………… 40

1-14-2- ساختمان DNA…………………… 41

2-14-2- تکثیر DNA به روش PCR…………… 42

15-2- چرخه­هاي حرارتي …………………… 43

16-2- اجزاء واکنش PCR…………………… 46

1-16-2- DNA الگو …………………….. 46

2-16-2- پرایمرها …………………….. 47

3-16-2- DNA پلیمراز ………………….. 48

4-16-2- داکسی نوکلئوتید تری فسفات (dNTP) …. 49

عنوان                                         صفحه

 5-16-2- بافرها و MgCl₂ ……………….. 50

6-16-2- آنالیز محصولات…………………. 51

17-2- آشکارسازی و تجزیه و تحلیل الگوی باندهای DNA  52

18-2- مقدمه­ای بر تعیین توالی DNA………… 53

1-18-2- اصول کلی …………………….. 53

2-18-2- تعیین توالی DNA به روش دستی…….. 55

3-18-2- تعیین توالی اتوماتیک…………… 56

19-2- NADH dehydrogenase enzyme (ND)…………….. 56

1-19-2- شناسایی………………………. 56

2-19-2- مکانیسم عمل…………………… 57

3-19-2- ساختار……………………….. 58

4-19-2- مهار کننده­ها………………….. 58

20-2- ژنوم ميتوكندريائي…………………. 59

21-2- ژنوم هسته­اي…………………….. 59

22-2- روش RAPD-PCR…………………….. 60

23-2- روش PCR-RFLP……………………… 61

24-2- پلی­مرفیسم ژنتیکی و تکنیک­های شناسایی آن. 61

1-24-2- انواع پلی­مرفیسم ………………. 61

2-24-2- پلی­مرفیسم در یک نوکلئوتید (SNP) … 62

3-24-2- منشأ SNP……………………… 64

25-2- شناسایی پلی­مرفیسم…………………. 65

1-25-2- شناسایی پلی­مرفیسم در سطح پروتئین .. 65

2-25-2- شناسایی پلی­مرفیسم در سطحDNA …….. 66

3-25-2- روش­های اسکن کردن ……………… 66

عنوان                                         صفحه

4-25-2- روش­های غربال­گری (روش­های ژنوتیپی)… 67

26-2- کنترل……………………………. 67

فصل سوم: مواد و روش کار

1-3- مواد و وسائل………………………. 73

2-3- جمع­آوری نمونه …………………….. 74

3-3- روش رنگ­آمیزی با کارمین……………… 76

1-3-3- تهیه­ی رنگ کارمین……………….. 76

2-3-3- روش رنگ­آمیزی…………………… 76

4-3- روش میکرومتری……………………… 77

1-4-3- روش همسنگ کردن یا کالیبره کردن عدسی شیئی  78

5-3- استخراج DNA ……………………… 78

1-5-3- مراحل انجام کار………………… 79

6-3- تکثیر DNA ……………………….. 80

1-6-3- تهیه­ی رقت مناسب DNA الگو………… 80

2-6-3- استفاده از پرایمرهای اختصاصی…….. 80

3-6-3- آماده سازی و تهیه­ی غلظت پرایمرها جهت انجام PCR 81

4-6-3- مراحل انجام واکنش PCR…………… 82

7-3- الکتروفورز روی ژل آگارز…………….. 84

8-3- تعیین ترادف نوکلئوتیدی محصول PCR…….. 86

9-3- آنالیز سکانس­ها (ترادف­ها)……………. 86

10-3- تجزیه و تحلیل آماری نتایج………….. 87

عنوان                                         صفحه

فصل چهارم: نتايج

1-4- بررسی مرفومتریک……………………. 89

2-4- بررسی مولکولی……………………… 96

1-2-4- واكنش زنجيره­اي پليمراز……………. 96

3-4- آناليز سكانس­ها و تطابق چندگانه­ی ترادف­هاي ND1 و ITS-2

حاصل از انگل دیکروسلیوم در ايران………… 97

4-4- تطابق چندگانه­ی ترادف­هاي ITS-2 حاصل از انگل دیکروسلیوم

در ايران با ترادف­هاي ثبت شده در بانك ژني…. 101

5-4- نتايج حاصل از تغييرات احتمالي در نوع اسيدآمينه­ی شركت كننده

در ساختار پروتئيني آنزيم ND1……………. 106

بحث و نتيجه­گيري……………………….. 109

پیشنهادات…………………………….. 120

فهرست منابع

منابع فارسی ………………………….. 121

منابع انگلیسی…………………………. 124

فهرست جداول

عنوان                                         صفحه

جدول شماره­ی 1: مواد و وسائل به کار رفته در این مطالعه    73

جدول شماره­ی 2: مشخصات پرایمرهای اختصاصی مورد استفاده در PCR

گونه­ی دیکروسلیوم دندریتیکم……………….. 81

جدول شماره­ی 3: ترکیبات و غلظت مواد مورد استفاده جهت انجام PCR 82

جدول شماره­ی 4: برنامه­ی چرخه­ی حرارتی PCR ژن ITS-2 83

جدول شماره­ی 5: برنامه­ی چرخه­ی حرارتی PCR ژن ND1 83

جدول شماره­ی 6: نتايج اندازه­گيري شاخص­هاي مرفومتریک ایزوله­های

 گاوی و گوسفندی دیکروسلیوم دندریتیکم با نرم­افزار اتوکد

 در بین استان­های مورد مطالعه……………… 90

جدول شماره­ی 7: مقایسه­ی پارامترهای مرفومتریک ایزوله-های

 گاوی و گوسفندی دیکروسلیوم دندریتیکم اندازه­گیری شده با نرم­افزار اتوکد

 با استفاده از آزمون تی­تست غیرمستقل در ایران.. 92

جدول شماره­ی 8: نتايج اندازه­گيري شاخص­هاي مرفومتریک ایزوله­های

 گاوی و گوسفندی دیکروسلیوم دندریتیکم به روش میکرومتری در بین

 استان­های مورد مطالعه……………………. 93

جدول شماره­ی 9: مقایسه­ی پارامترهای مرفومتریک ایزوله-های

گاوی و گوسفندی دیکروسلیوم دندریتیکم اندازه­گیری شده به روش میکرومتری

با استفاده از آزمون تی­تست غیرمستقل و من-ویتنی در ایران   95

عنوان                                         صفحه

جدول شماره­ی 10: جايگاه نوكلئوتيدهاي داراي جابجايي در هاپلوتیپ­های

مختلف انگل دیکروسلیوم دندریتیکم در گاو و گوسفند در اين مطالعه    99

جدول شماره­ی 11- درصد تشابه ژنتیکی و تعداد اختلاف باز مشاهده شده

بر اساس ترادف ناحیه­ی ND1 میان ایزوله­های گاوی و گوسفندی

 انگل دیکروسلیوم دندریتیکم حاصل از این مطالعه. 100

جدول شماره­ی 12- درصد تشابه ژنتیکی و تعداد اختلاف باز مشاهده شده

بر اساس ترادف ناحیه­ی ITS-2 میان گونه­ها و سویه­های مختلف انگل دیکروسلیوم

 موجود در بانک ژن آمریکا و دو هاپلوتیپ مختلف دیکروسلیوم دندریتیکم

حاصل از این مطالعه………………………. 104

جدول شماره­ی 13: رمزهاي ترجمه­اي مربوط به اسیدآمینه­های كد شونده

در ترماتودها …………………………… 108

فهرست اشکال

عنوان                                         صفحه

شکل شماره­ی 1- انگل دیکروسلیوم چایننسیس…….. 11

شکل شماره­ی 2- چرخه­ی زندگی دیکروسلیوم دندریتیکم 15

شکل شماره­ی 3- انگل دیکروسلیوم دندریتیکم……. 35

شکل شماره­ی 4- تفاوت ساختاری dATP و ddATP……. 54

شکل شماره­ی 5- تفاوت مولکول 2 & DNA 1 در یک نوکلئوتید

 (یک پلی­مورفیسم C/T)……………………… 63

شکل شماره­ی 6- مکان­های جمع­آوری نمونه­های انگل دیکروسلیوم دندریتیکم

 از گاو و گوسفند در ایران………………… 75

شکل شماره­ی A7- باندهاي حاصل از محصولات PCR ایزوله­های

گاوی و گوسفندی دیکروسلیوم دندریتیکم با استفاده از زوج پرايمر

 ND1–Forward و ND1-Reverse در مقایسه با مارکر مولکولی 100

جفت بازی (گوده 5 A) و  8 A(کنترل منفی)……….. 96

شکل شماره­ی B7- باندهاي حاصل از محصولات PCR ایزوله­های گاوی و

گوسفندی دیکروسلیوم دندریتیکم با استفاده از زوج پرايمر

Forward   ITS-2-و ITS-2- Reverse در مقایسه با مارکر مولکولی 100 جفت بازی

 (گوده 5 B) و 1 B (کنترل منفی)………………. 97

عنوان                                         صفحه

شکل شماره­ی 8- نمودار درخت فیلوژنتیک ایزوله­های گاوی

 و گوسفندی دیکروسلیوم دندریتیکم بر اساس ژن ND1 با استفاده از روش UPGMA،

حروف لاتین نشان دهنده­ی هاپلوتیپ­ها می­باشند…… 101

شکل شماره­ی 9- تطابق چندگانه­ی حاصل از توالی ITS-2 ایزوله­های

 دیکروسلیوم دندریتیکم، ارینتالیس، چایننسیس و هاسپس، نوکلئوتیدها

در زمینه­های خاکستری تفاوت­های بین و داخل گونه­ای را نشان می­دهند………………………………………. 103

شکل شماره­ی 10- نمودار درخت فیلوژنی حاصل از آنالیز ناحیه­ی ITS-2

انگل دیکروسلیوم دندریتیکم مطالعه­ی حاضر و سایر گونه­های مرتبط ثبت شده

 در بانک ژن با استفاده از روش Maximum Parsimony…. 105

شکل شماره­ی 11- نمودار درخت فیلوژنی حاصل از آنالیز ناحیه­یITS-2

 انگل دیکروسلیوم دندریتیکم مطالعه­ی حاضر و سایر گونه­های مرتبط ثبت شده

در بانک ژن با استفاده از روش Neighbor–joining……. 105

شکل شماره­ی 12- نمودار درخت فیلوژنی حاصل از آنالیز ناحیه­یITS-2

انگل دیکروسلیوم دندریتیکم مطالعه­ی حاضر و سایر گونه­های مرتبط ثبت شده

در بانک ژن با استفاده از روش UPGMA……….. 105