غربال فنوتيپي و مولکولي مقاومت چغندرقند نسبت به نماتد مولد گره ريشه (Meloidogyne javanica)

فهرست مطالب 

عنوان                                                                                                                 صفحه

فصل اول: مقدمه

1-1 گياه­شناسی و اهميت چغندرقند…………………….. 2

1-2 عوامل بيمارگر چغندرقند………………………… 3

1-3 بررسی مقاومت با استفاده از نشانگرهای مولکولی…….. 4

1-4 ريشه­های مويين القاء شده با باکتری Rhizobium rhizogenes … 5

1-5 هدف از تحقيق…………………………………. 5

فصل دوم: مروری بر مطالعات انجام شده

2-1 نماتدهای مولد گره ريشه (Meloidogyne spp. Gӧldi, 1887)…….. 8

2-1-1 طبقه­بندی، ریخت­شناسی و زیست­شناسی نماتدهای مولد گره ریشه 9

2-1-1-1 طبقه­بندی……………………………….. 9

2-1-1-2 مشخصات ریخت­شناسی……………………….. 11

2-1-1-3 زیست­شناسی و بیماری­زایی………………….. 13

2-2 مقاومت به بيماري­های ناشی از نماتدها……………. 15

2-2-1 بررسی مقاومت با استفاده از نشانگرهای مولکولی…. 18

2-2-1-1 نشانگر چند شکلی تک نوکلئوتیدی (SNP)………. 19

2-2-2 مكانيسم­هاي مقاومت و تحمل به نماتد مولد گره ريشه 21

2-3 نماتد مولد گره ريشه چغندرقند………………….. 22

2-4 استفاده از کشت ريشه­های مويين در بررسی­های بیوتکنولوژی  25

2-5 مطالعه مقاومت به نماتد مولد گره ريشه در ايران…… 27

فصل سوم: مواد و روش­ها

3-1 نمونه‌برداری و جمع‌آوری بيمارگر…………………. 32

3-2 خالص‌سازی نماتد مولد گره ريشه چغندرقند………….. 32

3-2-1 استفاده از ارقام حساس گوجه‌فرنگی جهت مایه­زنی تک کيسه تخم نماتد…………………………………………….. 32

3-2-2 بررسي توليدمثل نماتد بر روي گياهان مایه­زنی شده. 35

3-2-3 تکثير زادمایه……………………………. 35

3-3 بررسي­هاي ريخت­سنجي و ریخت­شناسي جدايه­هاي نماتد مولد گره ریشه چغندرقند………………………………………………. 36

3-3-1 تثبیت نماتدها و تهیه اسلایدهای میکروسکوپی دائم.. 36

3-3-2 تهیه الگوی اثر انگشتی انتهای بدن نماتد ماده بالغ 36

3-3-3 اندازه­گیری شاخص­های ریخت­سنجی و بررسی شاخص­های ریخت­شناسی  37

3-3-4 آزمایش میزبان­های افتراقی جهت تعیین نژاد نماتد مولد گره ریشه چغندرقند……………………………………… 37

3-4 غربال مقاومت ژرم­پلاسم چغندرقند نسبت به نماتد مولد گره ریشه در سه آزمایش گلخانه­ای…………………………………. 38

3-4-1 تهيه، ضدعفوني و کاشت بذور…………………. 38

3-4-2 آماده­سازی زادمایه نماتد…………………… 39

3-4-2-1 مایه­زنی گیاهچه­ها………………………. 40

3-4-3 روش بررسی مقاومت گیاهان…………………… 40

3-5 آزمایش تعيين سطح بهینه زادمایه نماتد جهت آلودگی چغندرقند نسبت به نماتد مولد گره ریشه……………………………… 41

3-6 آزمایش غربال فنوتيپي مقاومت به نماتد مولد گره ريشه در تعدادی از ژنوتیپ­های چغندرقند………………………………. 41

3-7 آزمایش ارزیابی مقاومت تعدادی از ژنوتیپ­های چغندرقند نسبت به نماتد مولد گره ریشه…………………………………… 42

3-8 تجزیه و تحلیل آماری داده­های گلخانه­ای…………… 42

3-9 تولید ریشه­های مویین در ژنوتیپ­های مقاوم و حساس با استفاده از باکتری………………………………………………. 43

3-9-1 بافر، محيط کشت و محلول­های مورد استفاده در کشت بافت 43

3-9-2 کشت و نگهداري باکتري Rhizobium rhizogenes………… 45

3-9-3 توليد ريشه­هاي مويين………………………. 46

3-9-3-1 استفاده از گياهچه­هاي گلخانه­ای جهت توليد ريشه­های مويين    46

3-9-3-2 استفاده از گياهچه­هاي سترون درون شيشه­اي جهت توليد ريشه­های مويين……………………………………………. 47

3-9-3-3 مايه­زنی ریز نمونه­ها با باکتری Rhizobium rhizogenes و توليد ريشه مويين……………………………………….. 49

3-9-3-3-1 رشد ریشه­های مویین در محیط کشت مایع……. 51

3-9-3-3-2 استقرار ریشه­های مویین در محیط کشت جامد… 52

3-9-4 تجزیه و تحلیل آماری القاء ریشه مویین……….. 52

3-10 ارزیابی مولکولي مقاومت تعدادی از ژنوتيپ­هاي در دست بررسي  52

3-10-1 استخراج DNA از گياهان چغندرقند……………. 52

3-10-1-1 ارزيابي کيفيت و کميت DNA ژنومي استخراج شده. 53

3-10-2 انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز جهت تکثير باند 600 جفت بازي   53

3-10-2-1 تعيين توالي باند 600 جفت بازي………….. 55

3-10-3 طراحي آغازگرها………………………….. 55

3-10-3-1 انجام واکنش زنجيره­اي پليمراز با استفاده از آغازگرهاي طراحي شده…………………………………………. 56

فصل چهارم: نتایج و بحث

4-1 خالص‌سازی و تکثير نماتد مولد گره ريشه چغندرقند…… 59

4-1-1 بحث…………………………………….. 61

4-2 گونه­های شناسایی شده نماتد مولد گره ریشه چغندرقند… 61

4-2-1 گونه Meloidogyne javanica (Treub, 1885) Chitwood, 1949…….. 62

4-2-1-1 بررسی شاخص­های ریخت­شناسی و ریخت­سنجی………. 62

4-2-1-2 بحث………………………………….. 79

4-2-2 گونه Meloidogyne arenaria (Neal, 1889) Chitwood, 1949……… 83

4-2-2-1 بررسی­ شاخص­های ریخت­شناسی و ریخت­سنجی………. 83

4-2-2-2 آزمایش میزبان­های افتراقی……………….. 89

4-2-2-3 بحث………………………………….. 90

4-2-3 بحث کلی تشخیص گونه­های نماتد مولد گره ریشه…… 91

4-3 غربال مقاومت/حساسیت ژرم­پلاسم چغندرقند نسبت به نماتد مولد گره ریشه………………………………………………. 96

4-3-1 زادمایه بهینه جهت آلودگی چغندرقند نسبت به نماتد مولد گره ریشه…………………………………………….. 96

4-3-1-1 بحث………………………………….. 98

4-3-2 غربال فنوتيپي مقاومت به نماتد مولد گره ريشه…. 101

4-3-3 ارزیابی مقاومت به نماتد مولد گره ریشه در تعدادی از ژنوتیپ­های چغندرقند……………………………………… 103

4-3-3-1 بحث………………………………….. 106

4-4 تولید ریشه­های مویین در ژنوتیپ­های مقاوم و حساس با استفاده از باکتری……………………………………………… 114

4-4-1 توليد ريشه­های مويين از گياهچه­هاي گلخانه­ای…… 114

4-4-2 توليد ريشه­های مويين از گياهچه­هاي سترون درون شيشه­اي 114

4-4-3 رشد ریشه­های مویین در محیط کشت مایع…………. 117

4-4-4 استقرار ریشه­های مویین در محیط کشت جامد……… 118

4-4-5 بحث…………………………………….. 119

4-5 ارزیابی مولکولي مقاومت به نماتد مولد گره ریشه چغندرقند    125

4-5-1 استخراج DNA از گياهان چغندرقند……………. 125

4-5-2 تکثير قطعه 600 جفت بازي…………………… 125

4-5-2-1 تعيين توالي قطعه 600 جفت بازي…………… 126

4-5-3 بهینه­سازی PCR-CTPP برای غربال مقاومت چغندرقند.. 128

4-5-3-1 غربال ژنوتيپ­های مقاوم و حساس با استفاده از PCR-CTPP  130

4-5-4 بحث…………………………………….. 136

4-6 نتایج و بحث کلی غربال فنوتیپی و مولکولی مقاومت چغندرقند نسبت به نماتد مولد گره ریشه………………………………….. 142

4-7 پیشنهادها………………………………….. 146

فصل پنجم: منابع                                   147

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جدول­ها 

عنوان                                                                                                                     صفحه

جدول 3-1: طبقه­بندی شاخص گره یا کیسه تخم بر اساس روش تیلور و ساسر   38

جدول 3-2: ژرم­پلاسم چغندرقند ارزيابی شده در برابر نماتد مولد گره ريشه در سه آزمایش گلخانه­ای………………………………. 39

جدول 3-3: ترکيبات محيط کشت MS، ½ MS+B₅،  WPMو STW…… 44

جدول 3-4: ترکيبات محيط کشت باکتري Rhizobium rhizogenes……. 45

جدول 3-5: توالی آغازگرهای استفاده شده جهت غربال مقاومت ژنوتیپ­های چغندرقند………………………………………………. 53

جدول 3-6: ميزان و غلظت اجزاء واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از دو آغازگر نشانگر Nem06……………………………… 54

جدول 3-7: برنامه واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از دو آغازگر نشانگر Nem06………………………………………….. 54

جدول 3-8: ميزان و غلظت اجزاء واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از دو جفت آغازگر…………………………………………. 56

جدول 3-9: برنامه بهینه واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از دو جفت آغازگر………………………………………………. 57

جدول 4-1: جدایه­های خالص شده نماتد مولد گره ریشه چغندرقند  60

جدول 4-2: مشخصات ریخت­سنجی لارو، نر، ماده بالغ و الگوی اثر انگشتی گونه Meloidogyne……………………………………….. 71

ادامه جدول 4-2: مشخصات ریخت­سنجی…………………… 72

جدول 4-3: مشخصات ریخت­سنجی لارو، نر، ماده بالغ و الگوی اثر انگشتی گونه Meloidogyne……………………………………….. 73

ادامه جدول 4-3: مشخصات ریخت­سنجی…………………… 74

جدول 4-4: مشخصات ریخت­سنجی لارو، نر، ماده بالغ و الگوی اثر انگشتی گونه Meloidogyne……………………………………….. 75

ادامه جدول 4-4: مشخصات ریخت­سنجی…………………… 76

جدول 4-5: مشخصات ریخت­سنجی لارو، نر، ماده بالغ و الگوی اثر انگشتی گونه Meloidogyne……………………………………….. 77

ادامه جدول 4-5: مشخصات ریخت­سنجی…………………… 78

جدول 4-6: مشخصات ریخت­سنجی لارو، نر و ماده بالغ جمعیت­های دیگر گونه Meloidogyne………………………………………………. 79

جدول 4-7: مشخصات ریخت­سنجی لارو، ماده بالغ و الگوی اثر انگشتی گونه Meloidogyne………………………………………………. 87

جدول 4-8: مشخصات ریخت­سنجی لارو، نر و ماده بالغ جمعیت­های دیگر گونه Meloidogyne………………………………………………. 88

جدول 4-9: تشخيص گونه‌ها و نژادهاي نماتد مولد گره ريشه بر اساس ميزبان­هاي افتراقي………………………………………… 89

جدول 4-10: سطوح متفاوت زادمایه نماتد Meloidogyne javanica مایه­زنی شده بر روی رقم……………………………………………. 97

جدول 4-11: ارزيابي مقاومت تعدادی از ژنوتيپ­هاي چغندرقند مقاوم به نماتد سیستی…………………………………………. 103

جدول 4-12: ارزيابي مقاومت ژنوتيپ­هاي چغندرقند نسبت به گونه­هاي نماتد مولد گره ريشه………………………………….. 105

جدول 4-13: جدول تجزیه واریانس تمامی منابع تغییرات و اثر متقابل آنها در القاء ریشه…………………………………….. 116

جدول 4-14: توالی Confront primerهای جدید طراحی شده جهت غربال مقاومت/حساسیت……………………………………………… 128

جدول 4-15: ارتباط بین نشانگر چند شکلی تک نوکلئوتیدی و مقاومت فنوتیپی……………………………………………… 135

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست شکل­ها 

عنوان                                                                                                                     صفحه

شکل 3-1: ريشه‌های چغندرقند آلوده به نماتد مولد گره ريشه بعنوان منابع زادمایه………………………………………… 34

شکل 3-2: گوجه­فرنگی­های ارقام روتگرز، سوپرچیف و W جهت خالص‌سازی نماتد مولد گره ریشه……………………………………….. 34

شکل 3-3: انتقال تک کيسه تخم نماتد مولد گره ريشه بر روی ريشه گوجه‌فرنگی………………………………………………. 35

شکل 3-4: a: گلدان­های طلقی مورد استفاده برای آزمايش بررسی مقاومت، b: روش مایه­زنی………………………………………… 40

شکل 3-5: a: بذور جوانه زده و b: گیاهچه­های چغندرقند در محیط کشت MS  49

شکل 4-1: گره‌های روی ريشه‌های سطحی ارقام گوجه‌فرنگی‌ a: روتگرز و b: سوپرچیف……………………………………………. 60

شکل 4-2: نماتد ماده بالغ گونه Meloidogyne javanica، A-D ناحیه مری به ترتیب………………………………………………. 65

شکل 4-3: عکس­های میکروسکوپ نوری از الگوی اثر انگشتی گونه Meloidogyne javanica……………………………………………. 66

شکل 4-4: عکس­های میکروسکوپ نوری از ناحیه سر نماتد ماده بالغ گونه Meloidogyne javanica……………………………………….. 66

شکل 4-5: نماتد نرگونه Meloidogyne javanica، A، D، G و J بخش جلویی بدن به ترتیب……………………………………………. 67

شکل 4-6: عکس­های میکروسکوپ نوری از شکل سر و استایلت نماتد نر گونه Meloidogyne javanica……………………………………….. 68

شکل 4-7: عکس­های میکروسکوپ نوری از بخش­های مختلف نماتد نر گونه Meloidogyne javanica……………………………………….. 68

شکل 4-8: لارو سن دوم گونه Meloidogyne javanica، A وF نمای کلی بدن به ترتیب 69

شکل 4-9: عکس­های میکروسکوپ نوری از بخش جلویی بدن و استایلت لاروهای گونه……………………………………………. 70

شکل 4-10: عکس­های میکروسکوپ نوری از شکل دم لاروهای گونه Meloidogyne javanica……………………………………………. 70

شکل 4-11: گونه Meloidogyne arenaria، A: ناحیه مری نماتد ماده بالغ، B: نمای کلی…………………………………………. 85

شکل 4-12: عکس­های میکروسکوپ نوری گونه Meloidogyne arenaria؛ a و c: شکل کلی 86

شکل 4-13: گره­های تشکيل شده بر روی رقم حساس جلگه 70 روز پس از مايه­زنی با سطوح مختلف…………………………………… 97

شکل 4-14: تأثير سطوح متفاوت زادمايه نماتد Meloidogyne javanica در ميزان گره­زايی……………………………………………. 98

شکل 4-15: گره‌هاي روي ريشه‌ ارقام حساس چغندرقند a: جلگه، b: سانتا، c: کاکتوس و………………………………………….. 102

شکل 4-16: ریشه­های چغندرقند 70 روز پس از مایه­زنی با لارو سن دوم Meloidogyne javanica………………………………………. 104

شکل 4-17: ریز نمونه­های استفاده شده جهت توليد ريشه­های مويين؛ a: برگ و دمبرگ درون………………………………….. 115

شکل 4-18: ريشه­های مويين حاصل از تراريختگی ریز نمونه­های دمبرگ و برگ رقم حساس……………………………………….. 116

شکل 4-19: مقایسه میانگین اثر متقابل اسیدیته محیط القاء (P1=4.8 و P2=5.2) و نوع………………………………………… 117

شکل 4-20: رشد ریشه مویین a: رقم حساس پائولتا و b: ژنوتیپ مقاوم SB33 در محیط……………………………………….. 118

شکل 4-21: مقایسه رشد ریشه مویین رقم حساس پائولتا یک ماه پس از انتقال به محیط……………………………………….. 119

شکل 4-22: مقایسه رشد ریشه­های مویین (a و b: رقم حساس پائولتا) و 119

شکل 4-23: چاهک­های 1-21= DNA ژنومی استخراج شده از ژنوتیپ­های مختلف چغندرقند…………………………………………… 125

شکل 4-24: تکثیر قطعه 600 جفت بازی با استفاده از آغازگرهای Nem06FWD و Nem06REV……………………………………. 126

شکل 4-25: همردیفی بخشی از توالی نشانگر مقاومتی Nem06 تکثیر شده در جمعیت­های…………………………………………… 127

شکل 4-26: نمای شماتیک جهش نقطه­ای نوکلئوتید A به G در چند شکلی تک نوکلئوتیدی………………………………….. 129

شکل 4-27: الگوی الکتروفورزی بهینه­سازی شرایط واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از………………………………….. 130

شکل 4-28: الگوی الکتروفورزی واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از دو جفت آغازگر طراحی………………………………… 131

شکل 4-29: الگوی الکتروفورزی واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از دو جفت آغازگر طراحی ……………………………….. 132

شکل 4-30: الگوی الکتروفورزی واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از دو جفت آغازگر طراحی………………………………… 132

شکل 4-31: الگوی الکتروفورزی واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از دو جفت آغازگر طراحی ……………………………….. 133

شکل 4-32: الگوی الکتروفورزی واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از دو جفت آغازگر طراحی………………………………… 134