عنوان فهرست مطالب صفحه
خلاصه فارسی.. 1
مقدمه. 3
فصل اول: کلیات
1-1 کشف ویروس آنفلوانزا 7
1-2 طبقه بندی ویروس آنفلوانزا 8
1-2-1 ویروس آنفلوانزای A.. 9
1-2-2 ویروس آنفلوانزای B.. 10
1-2-3 ویروس آنفلوانزای C.. 11
1-3 مورفولوژی ویروس… 12
1-4 نامگذاری ویروس آنفلوانزا 13
1-5 ساختار ژنوم آنفلوانزا و پروتئینهای رمز گذاری شده توسط آن. 14
1-5-1 گلیکوپروتئین هماگلوتینین (HA) 15
1-5-2 پروتئين نورآمينيداز(NA) 17
1-5-3 پروتئینهایM1 و M2. 17
1-5-3-1 پروتئين M1 (پروتئين زمينه يا ماتريكس) 18
1-5-3-2 پروتئين M2 و عملكرد آن به صورت كانال يوني.. 18
1-5-4 کمپلکس پلیمرازی.. 19
1-5-5 نوکلئوپروتئین(NP) 20
1-5-6 پروتئين‌هاي غیرساختاری NS1 و NS2 (Non-Structural) 20
1-6 گونه ها و تنوع زیرنوعها 21
1-7 تکثیر ویروس آنفلوانزای تیپ A.. 23
1-7-1 جذب، ورود و بدون پوشينه شدن ويروس… 23
1-7-2 سنتز mRNA و همانند سازي RNA ويروسي.. 25
1-7-3 ترجمه، تجمع و جوانه زنی.. 26
1-8 اپیدمیولوژی آنفلوانزا 28
1-9 تغييرات ژنومي ويروس آنفلوانزا 29
1-10 سیستم نظارت WHO.. 33
1-11 گسترش بیماری.. 33
1-12 بیماری زایی.. 34
1-13 عملكرد دستگاه ايمني بر عليه ویروس آنفلوانزا 35
1-13-1 ایمنی ذاتی.. 35
1-13-2 ایمنی اکتسابی.. 36
1-13-2-1 ایمنی سلولی.. 37
1-13-2-2 پاسخ ایمنی هومورال. 38
1-13-2-3 ايمني مخاطي.. 40
1-14 داروهاي ضد آنفلوانزا 41
1- 15 مقاومت ویروس آنفلوانزا به داروها 43
1-16 واکسن آنفلونزای انسانی.. 44
1-16-1 واکسن غیر فعال شده 45
1-16-2 واکسن زنده تخفیف حدت یافته. 46
1-17 انتخاب سالیانه سویههای واکسن آنفلوانزای انسانی.. 48
1-18 کارایی واکسن.. 48
1-19 رویکردهای نوین در تولید واکسن.. 49
1-20 واکسن زیرواحد. 49
1-20-1 واکسنهای زیر واحد پروتئینی و پلی پپتیدی.. 50
1-20-2 تولید پروتئین های پاتوژن ها توسط تکنیک های نوترکیبی.. 51
1-20-3 واکسن های زیرواحدی چند ظرفیتی و ایمنی سلولی و همورال. 52
1-21 تولید واکسن با استفاده از پروتئین های حفظ شده 53
1-22 استفاده از ادجوانت ها 54
1-23 کاربرد ادجوانت… 54
1-24 طبقه بندی ادجوانت… 54
1-25 شایع ترین ادجوانتهای مورد استفاده 55
1-25-1 محدودیت ادجوانتهای استفاده شده در حال حاضر. 56
1-26 پروتئین های شوک حرارتی(HSPs) بعنوان ادجوانت… 56
1-26-1 پروتئین های شوک حرارتی(HSPs) به عنوان اجوانت و حامل.. 59
1-27 ضرورت انجام تحقیق.. 61
1-27-1 اهمیت تحقیق بر روی پروتئین M2 و M2e ویروس آنفلوانزا 61
1-27-2 معرفی ویروس آنفلوانزای (H1N1)novel A.. 62
1-28 اهداف پژوهش: 64
فصل دوم: مروری بر متون گذشته
2-1 پیشینهی بیماری آنفلوانزا 66
2-2 پیشینه تحقیقات انجام شده در زمینه ژن M2 و M2e. 70
فصل سوم: مواد و روشها
3-1 دستگاهها و وسایل عمومي مورد نياز. 77
3-2 روش های مورد استفاده در این پژوهش… 80
3-2-1 طراحی توالی ژن سنتتیک 3M2e. 81
3-2-2 بدست آوردن توالی HSP70 لیشمانیا ماژور. 82
3-2-3 بررسی خصوصیات توالی 3M2e طراحی شده و توالی 3M2e _ HSP70. 82
3-2-4 بازسازی پلاسمید pUC 57/3M2e سنتز شده 83
3-2-5 تکثیر و آماده سازی وکتور Puc57/3M2e. 83
3-2-6 ساخت محيط كشت مورد نياز باكتري.. 84
3-2-7 مستعد کردن باکتری مورد نظر جهت دریافت پلاسمید) Competant) 84
3-2-8 انتقال پلاسمید به درون باکتری مستعد شده به روش شوک حرارتي.. 86
3-2-9 استخراج و تخليص پلاسميد. 87
3-2-10 تعیین غلظت DNA.. 90
3-2-11 تکثیر و آماده سازی پلاسميد pET-28a. 91
3-2-12 بررسي صحت پلاسميد استخراج شده به روش الكتروفورز افقي.. 92
3-2-13 هضم آنزیمی وکتورهای Puc57/3M2e و pET-28a. 94
3-2-14 تخلیص وكتور pET-28a خطي شده 97
3-2-15 تخلیص ژن 3M2e. 98
3-2-16 دفسفریله کردن وکتور pET-28a. 100
3-2-17 اتصال ژن هدف به وکتور خطی شده (Ligation ) 102
3-3 شناسایی و تأیید پلاسمیدهای نوترکیب pET-28a/3M2e. 104
3-3-1 واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) 104
3-3-2 بررسي محصولات PCR به روش الكتروفورز. 108
3-3-3 هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب… 108
3-3-4 تعيين ترادف قطعه هدف… 109
3-4 تکثیر و آماده سازی وکتور نوترکیب pET-28a/HSP70. 110
3-4-1 تکثیر و آماده سازی وکتور Puc57/3M2e. 110
3-4-2 بررسي صحت پلاسميد استخراج شده به روش الكتروفورز افقي.. 111
3-4-3 هضم آنزیمی وکتورهای نوترکیب Puc57/3M2e و pET-28a/HSP70. 111
3-4-4 تخلیص وكتورنوترکیب pET-28a/HSP70خطي شده 113
3-4-5 تخلیص ژن 3M2e. 113
3-4-6 دفسفریله کردن وکتور نوترکیب pET-28a/HSP70. 113
3-4-7 اتصال ژن هدف به وکتور خطی شده (Ligation ) 114
3-5 شناسایی و تأیید پلاسمیدهای کایمرHSP pET-28a/3M2e. 116
3-5-1 بررسي محصولات PCR به روش الكتروفورز. 117
3-5-2 هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب… 117
3-5-3 تعيين ترادف قطعه هدف… 118
فصل چهارم: نتایج
4-1 بخش اول
4-1-1 نتیجه هضم آنزیمی وکتورpUC 57/3M2e. 120
4-1-2 نتيجه هضم آنزیمی وکتور pET28a. 121
4-1-3 نتایج جايسازي ژن 3M2e در وکتور بیانی pET28a. 122
4-1-4 نتایج حاصل از تائید تولید پلاسمید نوترکیب3M2e/ pET28a. 124
4-1-4-1 نتایج کلنی PCR.. 124
4-1-4-2 نتایج هضم آنزیمی پلاسمیدهای نوترکیب 3M2e /pET28a. 125
4-1-4-3 نتایج تعيين ترادف پلاسمید نوترکیب 3M2e /pET28a. 126
4-1-5 نتیجه هضم آنزیمی وکتور pUC 57/3M2e. 127
4-1-6 نتيجه هضم آنزیمی وکتور HSP70/ pET28a. 127
4-1-7 نتایج جايسازي ژن 3M2e در وکتور بیانی نوترکیب HSP70/ pET28a. 128
4-1-8 نتایج حاصل از تائید تولید پلاسمید نوترکیب HSP70/ 3M2e /pET28a. 130
4-1- 8-1 نتایج کلنی PCR.. 130
4-1-8-2 نتایج هضم آنزیمی پلاسمیدهای نوترکیب HSP70/ 3M2e /pET28a. 131
4-1-8-3 نتایج تعيين ترادف پلاسمید نوترکیب HSP70/ 3M2e /pET28a. 131
4-2 بخش دوم
4-2-1 بدست آوردن توالی پروتئین M2 و M2e. 133
4-2-2 بدست آوردن توالی پلی نوکلئوتیدی M2 و M2e. 134
4-2-3 طراحی توالی ژن 3M2e. 134
4-2-4 بدست آوردن توالی HSP70. 136
4-2-5 بررسی خصوصیات فیزیکوشیمیایی.. 137
4-2-6 شناسایی آنزیمهای برشی.. 140
4-2-7 بررسی عوامل دخیل در آنتیژنسیته در دو پروتئین 3M2e و HSP70_3M2e. 141
4-2-8 پیش بینی اپی توپهای خطی.. 144
فصل پنجم: بحث و پیشنهادات
5-1 مقدمه. 150
5-2 ساب کلونینگ… 151
5-3 واکسنهای زیرواحدی.. 153
5-4 معایب بالقوهی واکسن های زیر واحد. 155
5-5 واكسيناسيون عليه آنفلوانزاي novel A(H1N1) 156
5-6 انتخاب M2e به عنوان کاندید مناسب واکسن بر علیه ویروس آنفلوانزا 157
5-7 کارهای انجام شده در جهت بهبود ایمونوژنسیته M2e. 162
5-8 مطالعات موثر در پیشبرد اهداف این پژوهش… 163
5-9 نتایج بدست آمده از محاسبات بیوانفورماتیکی.. 166
5-10 نتیجه گیری.. 167
5-11 پیشنهادات برخواسته از نتایج تحقیق.. 168
5-12 پیشنهاد به سایر محققان. 168
منابع. 171
ضمائم. 122
خلاصه انگلیسی ………………………………………………………………………………………………………………………138
فهرست جداولعنوان صفحه |
|
جدول 1-1. سابتیپهای آنفولانزای A در گونههای مختلفجدول 1-2. ژنهای ویروس آنفولانزای A و عملکردشانجدول3-1: میزان مواد مورد نیاز برای هضم آنزیمی وکتورهای Puc57/3M2e و pET-28aجدول3-2. میزان مواد مورد نیاز برای دفسفریلاسیون وکتور pET-28aجدول 3-3. میزان مواد مورد نیاز برای Ligationجدول 3-4 میزان مواد مورد استفاده به ازای یک واکنش در کلنی PCRجدول 3-5. برنامهی دمایی PCR برای آنزیم Taq پلیمرازجدول3-6. میزان مواد مورد نیاز برای هضم آنزیمی وکتور نوترکیبجدول3-7. میزان مواد مورد نیاز برای هضم آنزیمی وکتورهای نوترکیب Puc57/3M2e و pET-28a/HSP70 جدول3-8. میزان مواد مورد نیاز برای دفسفریلاسیون وکتور نوترکیب pET-28a/HSP70جدول3-9 . میزان مواد مورد نیاز برای Ligationجدول 3-10. برنامهی دمایی PCR برای آنزیم Taq پلیمرازجدول3-11. میزان مواد مورد نیاز برای هضم آنزیمی وکتور نوترکیب کایمرجدول 4-1. توالی پروتئینی و مشخصات M2جدول 4-2. توالی پروتئینی و مشخصات HSP70جدول 4-3 بررسی خصوصیات فیزیکوشیمیایی توالیهای M2e 3M2e, 3M2e-HSP70, جدول 4-4 عوامل موثر در آنتیژنسیته در دو پروتئین 3M2e و HSP70_3M2eجدول4-5 تعداد اپی توپ، جایگاه شروع، جایگاه پایان هر اپی توپ، توالی اپی توپ و طول توالی M2eجدول4-6 تعداد اپی توپ، جایگاه شروع، جایگاه پایان هر اپی توپ، توالی اپی توپ و طول توالی 3M2eجدول4-7 تعداد اپی توپ، جایگاه شروع، جایگاه پایان هر اپی توپ، توالی اپی توپ و طول توالی3M2e_HSP70 جدول 1-5 توالیهای حفاظت شده ناحیه M2e ویروس آنفولانزاهای جدا شده از انسان |
101496102103107108109 112114115117118133136139142145 146 148160 |
فهرست نمودارهاعنوان صفحه |
|
نمودار 4-1 میانگین، کمینه و بیشینهی تمایل آنتیژنسیته اپیتوپ M2eنمودار 4-2 میانگین، کمینه و بیشینهی تمایل آنتیژنسیته اپیتوپ 3M2eنمودار 4-3 میانگین، کمینه و بیشینهی تمایل آنتیژنسیته اپیتوپ 3M2e_HSP70 |
145146147 |
فهرست شکلهاعنوان صفحه |
|
شکل 1-1. تصویر شماتیک ساختار ویروس آنفولانزا نوعAشکل 1-2. گلیگوپروتئین اصلی ویروس آنفلوانزای A(هماگلوتینین)شکل 1-3. گونه ها و تنوع زیرنوعها و میزبانهای مختلف ویروس آنفلونزاشکل 1-4. ورود ویروس به درون سلول میزبان توسط آندوسیتوزشکل 1-5. سنتز mRNA ویروس آنفولانزاشکل 1-6. چرخه تکثیر ویروس آنفولانزاشکل1-7 . تصویری شماتیک از چگونگی ایجاد پاندمیشکل 1-8 . مدل تکاملی از دریفت آنتیژنی ویروس آنفولانزا در انسانشکل 1-9. . تصویری ساده از شیفت و دریفت آنتیژنیشکل 1-10. دو راه انتقال آنفلونزای پرندگانشکل 1-11. تشکیل آنفلونزای بیماریزای انسانی از سویه بیماریزای مرغی در اثر تماس انسان با پرندگانشکل 1-12. تصویری شماتیک از چگونگی ایجاد ایمنی اکتسابی و ذاتی بر علیه ویروس آنفولانزاشکل1-13. تصویری شماتیک از چگونگی ایجاد ایمنی مخاطی بر علیه ویروس آنفولانزا.شکل 1-14. انواع واکسنهای غیر فعال ویروس آنفولانزاشکل 4-1. هضم آنزیمی وکتور. pUC 57/3M2eشكل4-2. الكتروفورز پلاسميد pET28aشکل 4-3. کلنیهای E. coli TOP10F’ حاوی پلاسمید نوترکیب pET28a-3M2شکل 4-4. نتیجهی کلنی PCRشکل 4-5. هضم آنزیمی وکتور3M2e /pET28aشکل 4-6 هضم آنزیمی وکتور HSP70 /pET28a و pUC 57/3M2eشکل 4-7. نتیجهی کلنی PCRشکل 4-8. هضم آنزیمی وکتور HSP70/ 3M2e /pET28aشکل 4-9 تصویر شبیه سازی شده از پروتئین 3M2e شکل 4-10. آنزیمهای برشی و جایگاههای برش آنها در توالی ژن 3M2eشکل 4-11. آنزیمهای برشی و جایگاههای برش آنها در توالی ژن HSP70شکل 4-12. تعیین نمره آنتی ژنسیته پروتئینHSP70شکل 4-13. تعیین نمره آنتی ژنسیته پروتئین3M2e |
91622242528293031323429404145121122124125126128130131137140141143144 |
اختصارات
Abbreviations
APC Antigen Presenting Cells
BHK Baby Hamster Kidney
Bp base pair
CMV Cyto MegaloVirus
COS CV-1 in Origin, carrying SV40
CTL Cytotoxic T Lymphocyte
cRNA complementary RNA
CNS Central Nervous System
DDW Double Distilled Water
DEPC Diethyl Pyrocarbonate
DEAE Diethylaminoethyl
DTT Dithiothreitol
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DNA Deoxyribonucleic Acid
dNTP Deoxynucleoside triphosphate
EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid
EGFP Enhanced green fluorescence protein
-
coli Escherichia coli
Cqoidy –
alternatives to allergy medication prescription allergy medication without antihistamines tablet for allergy on skin