%46تخفیف

جداسازی ژن رمزکننده یک پروتئین کیناز وابسته به کلسیم (CDPK32)درکلزا(Brassica napus) و بررسی بیان آن در پاسخ به تنش‌های غیر زنده

جداسازی ژن رمزکننده یک پروتئین کیناز وابسته به کلسیم (CDPK32)درکلزا(Brassica napus) و بررسی بیان آن در پاسخ به تنش‌های غیر زنده

تعداد113 صفحه در فایل word

کارشناسي ارشد در رشته‌ی

اصلاح نباتات

جداسازی ژن رمزکننده یک پروتئین کیناز وابسته به کلسیم **(CDPK32)درکلزا(Brassica napus) و بررسی بیان آن در پاسخ به تنش‌های غیر زنده**

فسفریله شدن قابل برگشت پروتئین‌ها مکانیسم بسیار مهمیبرای تنظیم فرآیندهای سلولی در پاسخ به تنش‌های محیطیاست. CDPK32یکیازپروتئینکیناز‌هایوابستهبهکلسیم است که نقش مهمی در شبکه انتقال سیگنال دارد. در این تحقیق ناحیه رمز شونده ژن BnCDPK32 در کلزا رقم SLM046 به طول 1617 جفت باز جداسازی، همسانه سازی و توالی یابی شد. انتهای cDNA ژن BnCDPK32 به کمک روشRACE جداسازی شد و سهقطعه3’utr و سه قطعه5’utr برای ژن BnCDPK32شناسایی شدند. بنابراین احتمال وجود سه پارالوگ از ژن BnCDPK32وجود دارد. محتمل‌ترین ارتولوگ ژن BnCDPK32 در گیاه شلغم‌روغنی در پایگاه داده Phytozome شناسایی شد که شباهت زیادی (58/98 درصد) با BnCDPK32 دارد. پروتئین BnCDPK32 دارای یک دامنه پروتئین کینازی و یک دامنه شبه‌کالمودولینی می‌باشد که این دامنه‌ها درکلزا، شلغم روغنی و آرابیدوپسیس حفظ شده‌اند. زمانی که گیاه کلزا در معرض تنش خشکی قرار داده شد بیان ژن BnCDPK32در ریشه در مقایسه با شرایط بدون تنش تغییری نشان نداد اما بیان این ژن در برگ در شرایط تنش خشکی زمانی که رطوبت خاکFC 48% استکاهش یافت. در شرایط تنش شوریبیان این ژن در سه ساعت پس از تنش به طور معنیداری افزایش یافته و پس از آن روند نزولی داشت.

کلید واژه: تنش خشکی، تنش شوری، کلزا، شلغم روغنی، آرابیدوپسیس،BnCDPK32

دسته: فنی و مهندسی, کشاورزی و منابع طبیعی برچسب: BnCDPK32, آرابیدوپسیس, تنش شوری, شلغم روغنی, کلزا, کلید واژه: تنش خشکی

توضیحات

فهرست مطالب

فصلاول

مقدمه 2

1-1- تنش 2

1-2- تنششوری 2

1-3-تنشخشکی 3

1-4- کلزا 4

1-5- شبکه‌هایسیگنالیتنش‌هایغیرزندهونقشپروتئینکینازها 6

1-6- وجود نسخه‌های متعددی از یک ژن در ژنوم کلزا 8

1-7- اهدافپژوهش 8

فصلدوم

مروریبرپژوهش‌هایپیشین 10

2-1-‌کينازها 10

2-1-1- اثریونکلسیم 10

2-1-2- پروتئینکینازهایوابستهبهکلسیم 11

2-2- پروتئینکینازوابستهبهکلسیمشماره 32 16

فصلسوم

موادوروش‌ها 20

3-1- جداسازی،همسانهسازیوتوالی‌یابیقطعهاولازcDNAژنCDPK32درکلزا(BnCDPK32) 20

3-1-1- نمونهبرداریازگیاه 20

3-1-2- طراحیآغازگرهایاختصاصیبرایتکثیرقطعهاولژنBnCDPK32 20

3-1-3- استخراجRNAازبرگکلزا 22

3-1-4 الكتروفورزژلآگارز 24

3-1-4-1- تهيهTBE (10X) 24

3-1-4-2- تهيهژلآگارز 1% و انجام الکتروفورز 24

3-1-4-3- تهيهLoading dye 6X 25

3-1-5- تیمارDNase نمونه‌‌یRNAبهمنظورازبینبردنآلودگیژنومی 25

3-1-6- سنتزcDNAتکرشته 26

3-1-7- تکثیرقطعهاولcDNAژنBnCDPK32بااستفادهازواکنشزنجیره‌ایپلیمراز 27

3-1-8- همسانه‌سازیقطعهموردنظردرونپلاسمید 29

3-1-8-1- اتصالقطعهموردنظردرونناقلپلاسمیدی 30

3-1-8-2- انتقالپلاسمیدنوترکیبpTZ57R/TبهباکتریE.coliسویهDH5 alpha 31

3-1-8-3- ساختمحیطکشتLBمایعوجامدمناسبرشدباکتری 33

3-1-8-4- انتخاب همسانه‌های حاوی پلاسمید نوترکیب 34

3-1-8-5- استخراج پلاسمید نوترکیب 34

3-1-8-6- هضم آنزیمی پلاسمیدهای نوترکیب 35

3-2- جداسازی،همسانهسازیوتوالی‌یابیقطعهدومازcDNAژنBnCDPK32 35

3-2-1- طراحیآغازگرهایاختصاصیبرایتکثیرقطعهدومژنBnCDPK32 35

3-2-2- تکثیرقطعهدومژنBnCDPK32بااستفادهازواکنشزنجیره‌ایپلیمراز 36

3-3- جداسازینواحیانتهاییcDNAژنBnCDPK32باروشRACE 36

3-3-1- جداسازیوتوالی‌یابیانتهای3^‘از cDNAژنBnCDPK32 37

3-3-1-1- استخراجRNA 37

3-3-1-2- طراحیآغازگرهایاختصاصیبرایتکثیرانتهای3’ازcDNAژنBnCDPK32 39

3-3-1-3- واکنشزنجیره‌ایپلیمرازاول بهمنظورتکثیرانتهای 3’ازcDNAژنBnCDPK32 39

3-3-1-4- تکثیرانتهای3’ژنBnCDPK32بااستفادهازواکنشزنجیره‌ایپلیمرازآشیانه‌ای 40

3-3-1-5- خالص‌سازیمحصولواکنشزنجیره‌ایپلیمرازازرویژلآگارزیکدرصد 42

3-3-2- جداسازیوتوالی‌یابیانتهای5^‘از cDNAژنBnCDPK32 43

3-3-2-1- خالصسازیرشتهاولcDNA 43

3-3-2-2- دنبالهدارکردنرشتهاولcDNA ساخته شده با آغازگر اختصاصی R3CDP 44

3-3-2-3- واکنشزنجیره‌ایپلیمرازاولبهمنظورتکثیرانتهای 5′ ازcDNAژنBnCDPK32 45

3-3-2-4- تکثیرانتهای5′ از cDNAژنBnCDPK32بااستفادهازواکنشزنجیره‌ایپلیمرازآشیانه‌ای 46

3-4- شناساییتوالیژنCDPK32درBrassica rapa 47

3-5- بررسیبیانژنBnCDPK32درپاسخبهتنش‌هایخشکیوشوری 47

3-5-1- اعمالتنشخشکی 47

3-5-2- اعمالتنششوری.. 49

3-5-3- طراحیآغازگرهایاختصاصیبرایبررسیبیانژنBnCDPK32 50

3-5-4- واكنش Real time RT-PCRژنBnCDPK32وژنكنترلداخليBnef1 51

3-5-5- نرمالسازيبيانژنBnCDPK32پسازواكنش Real-time RT PCR 52

فصلچهارم

نتایج 55

4-1- استخراجRNAازبرگگیاهکلزا 55

4-2- جداسازیقطعهاولازcDNAژنBnCDPK32 کلزا 55

4-3- همسانهسازیمحصولواکنشزنجیره‌ایپلیمرازقطعهاولازcDNAژنBnCDPK32 کلزا 56

4-4- تعیینتوالیقطعه‌ياولتکثیرشدهازcDNAژنBnCDPK32 58

4-5- جداسازیقطعهدومازcDNAژنBnCDPK32 کلزا 59

4-6- همسانهسازیمحصولواکنشزنجیره‌ایپلیمرازقطعهدومازcDNAژنBnCDPK32 کلزا 60

4-7- تعیینتوالیقطعه‌يدومتکثیرشدهازcDNAژنBnCDPK32 61

4-8- جداسازينواحیانتهایيازcDNAژنBnCDPK32باروشRACE 63

4-8-1- جداسازيانتهاي3’ازcDNAژنBnCDPK32 63

4-8-2- خالص‌سازیقطعات تکثیر شده انتهاي3’ازcDNAژنBnCDPK32ازرویژلآگارز 65

4-8-3- تعیینتوالیانتهای3’تکثیرشدهازcDNAژنBnCDPK32 65

4-8-4- جداسازيانتهاي5’ازcDNAژنBnCDPK32 68

4-8-5- خالص‌سازی قطعات تکثیر شده انتهای 5’ازcDNAژنBnCDPK32ازرویژلآگارز 69

4-8-6- تعیینتوالیانتهای5’تکثیرشدهازcDNAژنBnCDPK32 70

4-9- تعیینناحیه رمز شونده ژنBnCDPK32درکلزا 73

4-10- شناساییژنCDPK32درBrassica rapa 75

4-11- مقایسه شباهتساختاریCDSژنBnCDPK32باارتولوگ‌هایش در شلغمروغنیوآرابیدوپسیس 76

4-12- توالیآمینواسیدوبررسیدنباله‌هایپروتئینیژنCDPK32درکلزا،شلغمروغنیوآرابیدوپسیس 79

4-13- بررسیفیلوژنتیکیپروتئینCDPK32 85

4-14- شبکهپروتئینیCDPK32درآرابیدوپسیس 88

4-15- بررسيالقایبیانژنBnCDPK32درپاسخبهتنش‌هایغیر‌زیستیباروش Real time RT-PCR 90

4-15-1- بررسيالقایبیانژنBnCDPK32درریشهدرپاسخبهتنش‌خشکیباروش Real time RT-PCR 90

4-15-2- بررسيالقایبیانژنBnCDPK32دربرگدرپاسخبهتنش‌خشکیباروش Real time RT-PCR 92

4-15-3- بررسيالقایبیانژنBnCDPK32درریشهدرپاسخبهتنش‌شوریباروش Real time RT-PCR 93

4-16- نتیجهگیریکلی 94

4-17- پیشنهادات 97

فهرستمنابع 98

فهرست جدول‌ها

جدول3-1- آغازگرهاياختصاصیطراحیشدهبرایجداسازیقطعهاولcDNAژنBnCDPK32درکلزا(BnCDPK32). 22

جدول 3-2- موادلازمجهتتهیهبافرTBE 24

جدول 3-3- مقادیرموادمورنیازبرایتهیهLoading dye 6X 25

جدول3-4- موادموردنیازبرایمرحلهاولتیمارDNase 26

جدول 3-5- موادموردنیازدرمرحلهاولسنتزcDNAتکرشته 26

جدول 3-6- موادموردنیازدرمرحلهدومسنتزcDNAتکرشته 27

جدول3-7- موادمورداستفادهبرایتکثیرقطعهاولcDNAژنBnCDPK32درواکنشزنجیره‌ایپلیمراز 28

جدول3-8- چرخه‌دماییواکنشزنجیره‌ایپلیمرازبرایتکثیرقطعهاولcDNAژنBnCDPK32 28

جدول3-9- مخلوطواکنشاتصالقطعهاولcDNAژنBnCDPK32 30

جدول 3-10- موادلازمبرایساختمحیطLBمایعمناسبرشدباکتری 33

جدول3-11- موادافزودنیبهمحیطکشتLBجامدجهتغربالگریوتشخیصهمسانه‌هایسفیدوآبی 33

جدول 3-12- مواد استفاده شده درواکنش هضم آنزیمی پلاسمید‌های نوترکیب 35

جدول3-13- آغازگرهاياختصاصیطراحیشدهبرایجداسازیقطعهدومcDNAژنBnCDPK32 36

جدول3-14- چرخه‌دماییواکنشزنجیره‌ایپلیمرازبرایتکثیرقطعهدومcDNAژنBnCDPK32 36

جدول3-15- آغازگرهاياختصاصیطراحیشدهبرایجداسازیانتهای3’از cDNAژنBnCDPK32 39

جدول3-16- آغازگرهايOligo-dT anchor و PCR-anchorموجوددرکیت5’/3’RACE شرکت Roche 39

جدول 3-17- موادمورداستفادهدرواکنشزنجیرهایپلیمرازاول3’RACE 40

جدول3-18- چرخه‌دماییواکنشزنجیره‌ایپلیمرازبهمنظورتکثیرانتهای 3’از cDNA ژن BnCDPK32 40

جدول 3-19- مواداستفادهشدهدرواكنشزنجیرهایپلیمرازآشیانه‌ای3′ RACE 41

جدول3-20- چرخه‌دماییواکنشزنجیره‌ایپلیمرازآشیانه‌ایبرایتکثیرانتهای3’ازcDNAژنBnCDPK32 41

جدول3-21- آغازگرهاياختصاصیطراحیشدهبرایجداسازیانتهای5’ازcDNAژنBnCDPK32 43

جدول 3-22- مواداستفادهشدهدرواكنشدنبالهدارکردنانتهای3’رشتهاولcDNAساخته شده با آغازگر اختصاصی R3CDPبرای5’RACE 45

جدول 3-23- موادمورداستفادهدرواکنشزنجیرهایپلیمرازاول5’RACE 46

جدول3-24- چرخه‌دماییواکنشزنجیره‌ایپلیمرازاولبهمنظورتکثیرانتهای 5′ 46

جدول 3-25- موادمورداستفادهدرواکنشزنجیرهایپلیمرازآشیانه‌ای5’RACE 47

جدول 3-26- آغازگرهاياختصاصیطراحیشدهبرایبررسیبیانژنBnCDPK32وژنکنترلداخلیBnef1 50

جدول 3-27- موادمورداستفادهدرواکنشReal-Time PCRبرایتکثیرژنBnCDPK32وژنکنترلداخليBnef1 51

جدول 3-28- چرخهگرمايياستفادهشدهدرواكنشReal-time PCRژنBnCDPK32 و ژن کنترل داخليBnef1 52

فهرست شکل‌ها

شکل 1-1- روابطژنومیگونه‌هایزراعیخانوادهBrassicaceaeمعروفبهمثلثU 5

شکل 1-2- رابطهاجدادیکلزا(B.napus) وآرابیدوپسیس(A.thaliana)(Rana et al., 2004). 6

شکل 1-3- مسیرانتقالسیگنالتنش‌هایخشکی،شوریوسرمادرگیاهان(Xiong et al., 2002). 7

شکل 2-1- شکلساختاریپروتئینکینازهایمربوطبهخانوادهبزرگCPK-SnRK 12

شکل 2-2- ساختار پروتئین CDPK در گیاه آرابیدوپسیس(Harmon, 2003)………………………………………..13

شکل 2-3- نمایشماتیکازشبکهسیگنال‌دهیوابستهبهABAکهنقشCDPKرادرسیتوپلاسموهستهنشانمی‌دهد ( Umezawa et al., 2010). 14

شکل 2-4- دسته‌بندی پروتئین کینازهای وابسته به کلسیم در گیاه آرابیدوپسیس……………………………………….15

شکل 2-5- موقعیتاینترون‌ها،اگزون‌هاومناطقUTRدرژنAtCDPK32. خطوطتیرهمناطقاینترونیهستند. 16

شکل 3-1 نمایهمسانهسازیمحصولواکنشزنجیره‌ایپلیمراز 29

شکل 3-2- نقشهناقلهمسانه‌سازیpTZ57R/Tبههمراهجایگاهآنزیم‌هایبرشی 31

شکل 3-3- مراحلرشدگیاهانکلزادراتاقکرشد 50

شکل 4-1-RNA‌هایاستخراجشدهازبرگکلزارقمSLM046بررویژلآگارز1٪ 55

شکل 4-2- محصولواکنشزنجیره‌ایپلیمرازقطعهاول از cDNA ژن BnCDPK32وژنکنترلواکنش(ef1)بررویژلآگارز1٪ با استفاده از آغازگرهای CPKF و CPKR 56

شکل 4-3-پلاسمیدنوترکیباستخراجشدهحاویقطعهاول ژن BnCDPK32بررویژلآگارز1٪ 57

شکل 4-4-.محصولهضمشدهپلاسمیدنوترکیبPTZ57R/Tباآنزیم‌هایبرشیEcoRIوHindIII بررویژلآگارز1٪ 57

شکل 4-5- نتیجهبلاستتوالیقطعهاولژن BnCDPK32درپایگاهدادهNCBI 59

شکل 4-6-محصولواکنشزنجیره‌ایپلیمرازقطعهدومcDNAژن BnCDPK32بررویژلآگارز1٪با استفاده از آغازگرهای F-frag و R-frag 59

شکل 4-7-پلاسمیدنوترکیباستخراجشدهحاویقطعهدومبررویژلآگارز1٪ 60

شکل 4-8-.محصولهضمشدهپلاسمیدنوترکیبباآنزیم‌هایبرشیEcoRIوPstIبررویژلآگارز1٪ 61

شکل 4-9- نتیجهبلاستتوالیقطعهدومcDNA ژن BnCDPK32درپایگاهدادهNCBI 62

شکل 4-10-محصولواکنشزنجیره‌ایپلیمرازآشیانه‌ایبررویژلآگارز1٪ با هدف جداسازی انتهای 3′ از cDNA ژن BnCDPK32 با آغازگرهایF_Nested و PCR anchor. 64

شکل 4-11-قطعاتخالص‌سازیشده انتهای 3′ از cDNA ژن BnCDPK32بررویژلآگارز 1٪ 65

شکل 4-12- نتایجحاصلازهمردیف‌سازیچندگانه3’utr‌هاباتوالیناحیههمپوشانORFژنBnCDPK32 67

شکل 4-13-محصول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز دوم بر روی ژل آگارز 1٪ با هدف جداسازی انتهای 5′ از cDNA ژن BnCDPK32 با استفاده ار آغازگرهای R1CDP و PCR anchor 69

شکل 4-14- قطعاتخالص‌سازیشده انتهای 5′ از cDNA ژن BnCDPK32بررویژلآگارز1٪ 70

شکل 4-15- نتایجحاصلازهمردیف‌سازیچندگانه5’utr‌هاباتوالیناحیههمپوشانORFژنBnCDPK32 72

شکل 4-16- توالیمربوطبهORFژنBnCDPK32به طولbp1617 74

شکل 4-17- نتیجهبلاستناحیهORFژن BnCDPK32درپایگاهدادهNCBI 75

شکل 4-18- محتمل‌ترینتوالیمربوطبهژنCDPK32درگیاهشلغمروغنی 76

شکل 4-19- نتایج حاصل از همردیف‌سازی ناحیه رمز شونده (CDS) ژن CDPK32 در سه گیاه کلزا، شلغم‌روغنی و آرابیدوپسیس 77

شکل 4-20- توالیآمینواسیدیBnCDPK32،BrCDPK32وAtCDPK32 80

شکل 4-21- دامنه‌هایپروتئینیCDPK32درگیاهانکلزا،شلغمروغنیوآرابیدوپسیس 80

شکل 4-22- نتایجحاصلازهمردیف‌سازیتوالیآمینواسیدیژنCDPK32درسهگیاهکلزا،شلغمروغنیوآرابیدوپسیسبهکمکنرم افزارClustalW2 81

شکل 4-23- ساختارسهبعدیBnCDPK32مدل‌سازیشدهتوسطسرویسPhyre2 . 82

شکل 4-24-: ساختارسهبعدیBrCDPK32مدل‌سازیشدهتوسطسرویسPhyre2 83

شکل 4-25- ساختارسهبعدیAtCDPK32مدل‌سازیشدهتوسطسرویسPhyre2 . 83

شکل 4-26- ویژگی‌هایساختاریپروتئینBnCDPK32 84

شکل 4-27- ویژگی‌هایساختاریپروتئینBrCDPK32 84

شکل 4-28- ویژگی‌هایساختاریپروتئینAtCDPK32 84

شکل 4-29- مشخصات پروتئین‌های مورد استفاده در درخت فیلوژنتیکی BnCDPK32 86

شکل 4-30- درخت فیلوژنتیکی پروتئین BnCDPK32 با پروتئین‌های CDPK32 از گیاهان مختلف 87

شکل 4-31- شبکهپروتئینیCDPK32 در آرابیدوپسیس 88

شکل 4-32- مشخصات پروتئین‌های در ارتباط با شبکه پروتئینی CDPK32 در آرابیدوپسیس 89

شکل 4-33- الگویالقایبیانژنBnCDPK32درریشهدرپاسخبهتنشخشکی 91

شکل 4-34- الگویالقایبیانژنBnCDPK32دربرگدرپاسخبهتنشخشکی 92

شکل 4-35- الگویالقایبیانژنBnCDPK32درریشهدرپاسخبهتنششوری 93

امتیاز 0 از 5 از 0 دیدگاه

قیمت اصلی: 39,000 تومان بود.قیمت فعلی: 21,000 تومان.

تاریخ ایجاد دی 18, 1399
تاریخ بروزرسانی اسفند 13, 1401
فروش 0
دیدگاه 0

شرایط استفاده از محصول

تمام محصولات به ازای پرداخت پروژه تنها قابل استفاده می باشند. این بدین معنی است که برای استفاده از یک یا چند محصول ، لازم به خرید آن محصول است.

مزایای خرید این محصول:

دسترسی به فایل به صورت همیشگی
پشتیبانی رایگان
پشتیبانی 24 ساعته محصول
بازگشت وجه در صورت عدم رضایت مشتری

مشاهده قوانین سایت