جداسازی و کلونینگ ژن siat7e از سلولهای سرطانی بافت سینه

 

عنوان                                            فهرست مطالب                                              صفحه

خلاصه. 1

مقدمه. 2

فصل اول : کليات

1-1-ویروس آنفلوانزا 4

1-2- اسید سیالیک…. 5

1-3-ساختار اسید سیالیک…. 5

1-3-1 عملکردهای این قند را می توان به دو گروه تقسیم کرد: 7

1-4- متابولیسم اسید سیالیک…. 7

1-5- سیالیک اسید و پروتنینهای دارویی.. 9

1-6- گلیکوزیلاسیون : 10

1-7- گلیکوزیل ترانسفرازها (GT ) : 11

1-8- ساختارهای کریستالی کلی کوزیل ترانسفرازها : 12

1-9- سیالیل ترانسفرازها (EC 2.4.99.Y). 15

1-10- سکانسهای پروتئینی مشابهST  در گیاهان.. 15

1-11- سیالیل ترانسفرازهای پروکاریوتی.. 16

1-12- سیالیل ترانسفرازهای یوکاریوتی : 16

1-13- سازمان یابی ژنومی سیالیل ترانسفرازها. 19

1-14-مکانیسم کاتالیتیکی.. 22

1-15- بررسی ژن و پروتئین SIAT7e. 23

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

فصل سوم: مواد و روشها

3-1- وسایل و دستگاههای مورد نیاز: 30

3-2- تهیه محلولها و بافرها و محیطها. 31

3-2-2- روش تهیه محلول PBS  : 32

3-2-3- روش تهیه X 10 EDTA   – Trypsin : 32

3-2-4- طرز ساخت بافر10X  TBE : 32

3-3- آماده سازی سلول.. 33

3-3-1- پاساژ سلولها. 33

3-3-2-فریز کردن سلول: 34

3-4 استخراج RNA  از سلول : 35

3-5 واکنش نسخه برداری معکوس: 36

3-5-1- روش کار: 37

3-6 واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR  ). 38

3-6-1- مواد مورد استفاده جهت واکنش PCR : 39

3-7- بررسی محصولات PCR  از طریق الکتروفورز : 40

3-8- تخلیص ژن Siat7E.. 41

3-9- کلون نمودن محصولات  PCR در T- vector : 42

3-9-1- اتصال ژن موردنظر به وکتور خطی شده : 42

3-9-2- مستعد سازی سلولهای باکتریایی: 43

3-9-3- انتقال پلاسمید به درون باکتری مستعد شده به روش شوک حرارتی: 44

3-9-4- تهیه ماتریکس از T-Easy vector های نوترکیب: 45

3-9-5-  تائید تولید  T-Easy vector های نوترکیب به روش pcr : 45

3-10-استخراج و تخليص پلاسميد : 46

3-11- هضم آنزیمی وکتور T-Easy نوترکیب: 48

فصل چهارم : نتايج

4-1- نتایج حاصل از استخراج RNA  از سلولهای T47D : 50

4-2- نتایج حاصل از RT-PCR و PCR : 50

4-3- نتایج حاصل از کلونینگ : 54

4-4- نتایج حاصل از هضم آنزیمی قطعه  bp 400 : 56

4-5 – نتایج حاصل از سکوانسینگ : 56

فصل پنجم: بحث و پيشنهادات

5-1-ارتباط  SIAT7E و متاستاز در سرطان : 66

5-2-نتیجه گیری: 68

5-3-پیشنهادات: 69

    منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..70

    خلاصه انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………………………………76

     ضمائم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….77

عنوان                                  فهرست جداول                                  صفحه

جدول  1-1: تغییراتی که سبب افزایش نیمه عمر پروتئینهای درمانی می گردد………………… 10

جدول 1-2: نتایج مطالعه شناسایی پیچش……………………………………………………………… 15

جدول1-3 : بیان ST6GALNAC5 در بافت سینه برگرفته از اطلس ژنی………………………. 25

جدول 3-5-1: مواد مورد استفاده در مرحله اول واکنش سنتز  cDNA  ………………………  37

جدول3-5-2: مواد مورد استفاده در مرحله دوم سنتز cDNA …………………………………….  38

جدول 3-6-1: مواد مورد استفاده در واکنش PCR ………………………………………………… 39

جدول 4-2: شرائط  PCR جهت تکثیر ……………………………………………………………..  51

عنوان                                     فهرست اشکال                                صفحه   

شکل1-1 : نمایی از ویروس آنفلوانزا…………………………………………………………………….. 4

شکل1-2 : ساختار اسید سیالیک……………………………………………………………………………. 5

شکل1-3 : ساختار شیمیایی اسید سیالیک و لیست جایگزینها و موقعیتهای جایگزینی…………. 6

شکل 1-4 : ساختارهای آنالوگ اسید سیالیک……………………………………………………………. 7

شکل 1-5 : تغییر ساختار فضایی کربن آنومریک اسید سیالیک………………………………………. 8

شکل 1-6 : متابولیسم اسید سیالیک………………………………………………………………………… 9

شکل1-7 : اتصال اسید سیالیک به پروتئینها…………………………………………………………….. 11

شکل 1-8 : سه پیچش متفاوت در GTs ……………………………………………………………….. 14

شکل 1-9 : اسید سیالیک فعال شده…………………………………………………………………….. 17

شکل 1-10 :  انواع سیالیل ترانسفرازها  و الگوهای پیوندی آنان………………………………….. 18

شکل1-11 : نمایی از موتیفهای سیالیل ترانسفراز……………………………………………………… 19

شکل1-12 : موتیفهای محافظت شده سیالیل ترانسفرازها با ساختار GT-A……………………… 20

شکل 1-13 : پیچشGT29…………………………………………………………………………………. 21

شکل 1- 14 : آمینواسیدهای در گیر در اتصال سوبسترا……………………………………………… 22

شکل1-15 : خصوصیات ST6GALNAC5……………………………………………………………. 23

شکل 1-16 : نمایی از جایگاه ژن siat7e ……………………………………………………………. 23

شکل 1-17 : نمایی از جایگاه اگزونها بر روی mRNA…………………………………………….. 24

شکل 4-2-1 : نتیجه RT-PCR گرادیان دما……………………………………………………………. 52

شکل4-2-2: نتیجه RT-PCR گرادیان  Mgcl2 ……………………………………………………… 52

شکل 4-2-3 : حضور باند bp 410………………………………………………………………………. 53

شکل 4-2- 4 : حضور باند bp 108……………………………………………………………………… 54

شکل 4-3-1 : پلیت کشت باکتری……………………………………………………………………….. 55

شکل 4-3-2 : DNA حاصل از چند کلنی کشت ماتریکس………………………………………… 55

شکل 4-5-1 : نتایج حاصل از هضم آنزیمی محصول pcr   ……………………………………… 56