توليد آنتي ژن نوترکيب NcSAG1 Neospora caninum و استفاده از آن در تدوين روش لاتكس آگلوتيناسيون LAT) ) و مقايسه ارزش تشخيصي آن با کيت تجاري الايزا

فهرست مطالب

عنوان                                         صفحه

فصل اول: مقدمه…………………………… 2

فصل دوم: کليات

1-2- تاريخچه…………………………… 7

2-2- طبقه بندي انگل…………………….. 8

3-2- سير تکاملي و ساختمان انگل …………… 8

4-2- آنتي ژن‌هاي انگل…………………… 11

1-4-2- آنتي ژنهاي سطحي (Surface Antigens)…….. 13

2-4-2-  آنتي ژن هاي گرانول هاي متراكم…… 14

5- 2- تفريق نئوسپورا كانينوم از ساير گونه‌هاي انگلي 16

1-5- 2- هامونديا هيدورني (H. heydorni)……… 16

2-5- 2-  نئوسپورا هوگشي (N. hughesi)……….. 17

3-5- 2–توكسوپلاسما گندئي………………. 17

6- 2- انتقال ………………………….. 18

1-6- 2- انتقال عمودي………………….. 18

2-6- 2-انتقال افقي……………………. 19

3-6- 2- انتقال از راه شير……………… 20

4-6- 2- انتقال از راه جفتگيري………….. 20

7- 2- نشانه هاي باليني…………………. 21

1- 7- 2- گاو ………………………… 21

2- 7- 2- گوسفند………………………. 22

3- 7- 2- اسب…………………………. 23

4-7- 2- بز…………………………… 23

عنوان                                         صفحه

5-7- 2- سگ…………………………… 23

6- 7- 2- گربه………………………… 24

7- 7- 2- انسان……………………….. 24

8- 2- بيماريزايي………………………. 25

1- 8- 2- مکانيسم سقط جنين …………….. 26

2-8- 2-  آسيب هاي وارده به جفت  ………… 27

3- 8- 2- آسيب هاي وارده به جنين………… 27

9-2 – يافته‌هاي كالبدگشايي………………. 31

10-2-خسارات اقتصادي نئوسپوروزيس در گاو…… 31

11-2- عوامل مستعد كننده………………… 33

1-11-2-  حضور سگ ها…………………… 33

2-11-2-  ساير گوشتخواران………………. 33

3-11-2-  ميزبان‌هاي واسط به غير از گاو…… 33

4- 11-2- چراگاه، علوفه و آب شرب………… 34

5-11-2- سن گله……………………….. 34

6-11-2- خوردن شير يا آغوز……………… 34

7- 11-2- سرکوب ايمني …………………. 34

8- 11-2- تراكم گله و ابعاد مزرعه……….. 35

9-11-2- آب و هوا……………………… 35

10- 11-2- تراكم جمعيت انساني…………… 35

11-11-2- فصل و نژاد…………………… 35

12-11-2- پرورش……………………….. 35

12-2- ايمني…………………………… 36

13-2- تشخيص…………………………… 37

1- 13-2- روش‌هاي سرولوژيك………………. 38

1- 1- 13-2- روش ايمونو فلورسنت آنتي بادي غير مستقيم   (IFAT)………………………………….. 40

2- 1- 13-2- روش آگلوتيناسيون مستقيم  (DAT) . 41

3- 1- 13-2- روش الايزا ………………. 42

4-1- 13-2- تست لاتکس آگلوتيناسيون (LAT)… 42

2- 13-2 – روش هاي تشخيص بافتي………….. 46

عنوان                                         صفحه

1-2-13-2 –  هيستوپاتولوژي……………. 46

2-2-13-2 –  هيستوشيمي……………….. 47

3-2- 13-2 – ايمنوهيستوشيمي…………… 47

3-13-2 –  تكنيك‌هاي مولكولي…………… 48

4- 13-2 – استفاده از  مدل هاي حيواني….. 48

5-13-2 –  روش كشت سلول………………. 49

6-13-2 – تشخيص تفريقي……………….. 50

14-2 – درمان…………………………… 50

15-2 – پيشگيري و کنترل…………………. 51

16-2 – پروتئين هاي نوترکيب و اهميت آنها……… 52

1-16-2 – سيستم هاي بيان ژن براي توليد پروتئين هاي نو ترکيب 53

2-1-16-2 – سيستم هاي باکتريايي………….. 54

3-1-16-2- سيستمpET……………………. 54

4-1-16-2 –  سيستم مخمري و قارچي ……….. 54

5-1-16-2 – حشرات …………………….. 55

6-1-16-2  – سلول پستانداران …………… 55

فصل سوم: مواد و روش کار

1-3- طراحي پرايمرها…………………….. 58

2- 3- تهيه تاكي‌زوئيت نئوسپورا کانينوم……. 58

3- 3- استخراج DNA از تاكي‌زوئيتهاي نئوسپورا کانينوم خالص شده 59

۴- ۳- تکثير قسمتي از ژن NcSAG1 با روش PCR….. 60

5- ۳- خالص سازي باند مورد نظر از ژل آگاروز . 61

6- ۳- اتصال Ligation) ) محصول PCR در پلاسميد pTZ57R 62

7-3- تهيه ي سلول هاي پذيرا Competent cells)) از باکتري  E.coli GM2163 62

٨-٣- وارد کردن پلاسميد به درون سلول باکتري ( (Transformation  63

9-3- تأييد وجود پلاسميد حاوي قطعه ي ژن مورد نظر درون کولوني باکتري ………………………………. 63

۱۰- ۳- تعيين توالي پلاسميدهاي بدست آمده (Sequencing)    64

۱۱- ۳- برش قطعات حاوي NcSAG1 و پلاسميد  pET-28a.. 66

۱-۱۱- ۳- برش NcSAG1 و پلاسميد  pET-28a

 با آنزيم هاي NcoІ  و ІІІ Hind……………. 67

عنوان                                         صفحه

12- ۳- اتصال قطعات برش خورده ي NcSAG1 و پلاسميد  pET-28a(Ligation) 67

 -۱۳ ۳- تأئيد وجود قطعه هدف NcSAG1)) درون پلاسميد  pET-28a  67

-۱۴ ۳- انتقال وكتورحاوي ژن موردنظر به داخل باكتري E.coli BL21    68

-۱۵ ۳- بررسي چند كولوني رشد كرده براي ارزيابي وجود ژن كلون شده…………………………………….. 68

-۱۶ ۳- جداسازي پلاسميد SAG1-pET28 ………….. 69

-۱۷ ۳- برش پلاسميد با آنزيمهاي NcoІ و HindІІІ  و الكتروفورز محصول

 براي اطمينان از وجود قطعه مورد نظر در پلاسميد      69

-۱۸ ۳- انتخاب يك يا دو كلون براي توالي يابي (براي حصول اطمينان

از توالي درست ژن)……………………… 69

-۱۹ ۳- پس از حصول اطمينان از توالي ژن، كلون مورد نظر براي بيان ژن

مورد استفاده قرار مي گيرد………………. 69

۲۰-۳- خالص سازي (Purification) پروتئين هاي توليدشده به فرم گنجيدگي هاي

 درون سلولي(Inclusion body) تحت شرايط دناتوره کننده 70

۲۱-۳- حل کردن (Solubilization)و بازتاخوردگي ( Refolding) پروتئين هاي

توليدشده به فرم گنجيدگي هاي درون سلولي (Inclusion body) 71

۲۲- ۳- اندازه گيري غلظت پروتئين نوترکيب  NcSAG1به روش لوري   73

۲۳-۳- ارزيابي پروتئين نوتركيب خالص شده و بازتاخورده با استفاده از

SDS-PAGE  و وسترن بلاتينگ(Western Blotting)………. 74

۲۴- ۳- آزمايش وسترن بلاتينگ پروتئين ها…….. 75

1-24- ۳-  بلاتينگ …………………….. 75

2-24-3- مسدود سازي سطح کاغذ (Blocking)……. 75

3-24- ۳- اضافه کردن سرم ضد نئوسپورا…….. 76

4-24- ۳- اضافه کردن آنتي بادي کنژوگه……. 76

5-24- ۳- اضافه کردن محلول سوبسترا………. 76

۲۵- ۳- پوشاندن (Coating) ذرات لاتكس با آنتي ژن نوتركيب NcSAG1   77

۲۶- ۳- جمع آوري نمونه هاي سرم……………. 78

۲۷-۳- انجام تست لاتكس آگلوتيناسيون LAT) )….. 78

۲۸-۳- انجام تست الايزا………………….. 79

۲۹-۳- مقايسه ارزش تشخيصي تست لاتكس آگلوتيناسيون LAT) )

 بر اساس آنتي ژن نوترکيب NcSAG1 با تست الايزا . 79

عنوان                                         صفحه

فصل چهارم: نتايج

۱-۴- تکثير قسمتي از ژن NcSAG1 با روش PCR…… 81

۲-۴- کلون کردن ژن NcSAG1 در پلاسميد pTZ57R/T…. 82

۳-۴- استخراج پلاسميد از کلون 2163 E.coli GM حاوي قطعه ژني مورد نظر

در پلاسميد pTZ57R/T……………………….. 83

۴-۴- برش پلاسميد حاوي قطعه ژني و پلاسميدpET-28a  (کلون 2821)

با آنزيم ІІІ Hind ……………………….. 84

۵-۴- برش قطعه ژني و پلاسميدpET-28a  بريده شده با آنزيم ІІІ Hind، بوسيله

 آنزيم NcoІ……………………………. 85

۶-۴- خالص سازي قطعه ژني و پلاسميدpET-28a  بريده شده با آنزيم هاي

 ІІІ Hind و NcoІ………………………….. 86

۷-۴- کلون کردن قطعه ژني NcSAG1 بريده شده در پلاسميد pET-28a

 بريده شده با همان آنزيم ها…………….. 87

۸-۴- نتايج بيان پروتئين نوتركيب…………. 88

۹-۴- نتايج خالص سازي پروتئين نوترکيب توليدشده به فرم

 گنجيدگي هاي درون سلولي………………… 91

۱۰-۴- نتايج اندازه گيري غلظت پروتئين نوترکيب NcSAG1 به روش لوري…………………………………….. 93

۱۱-۴- نتايج حاصل از وسترن بلاتينگ پروتئين نوترکيب خالص شده

 تحت شرايط دناتوره کننده……………….. 94

۱۲-۴- نتايج حاصل از الکتروفورز و وسترن بلاتينگ پروتئين نوترکيب بازتاخورده……………………………. 95

۱۳-۴- نتايج حاصل از تست لاتكس آگلوتيناسيون… 95

فصل پنجم: بحث

پيشنهادات…………………………….. 103

فهرست منابع و مآخذ………………………. 104

 

پیوست………………………………….. 123

 

فهرست جدول ها

عنوان                                         صفحه

جدول ۱- ۳: ترکيب واکنش PCR با استفاده از پرايمر هاي  NeoNcoFو NeoHindR…………………………………. 60

جدول ۳-۲: ترکيب واکنش PCR با استفاده از پرايمرهاي ₁₃ M    64

جدول۳-۳: ترکيبات واکنش برش pTZ- NcSAG1 با آنزيم ІІІ  Hind 66

جدول ۳-۴: ترکيبات واکنش برش pTZ- NcSAG1 با آنزيم NcoІ   66

جدول ۵- ۳: ترکيبات واکنش اتصال قطعات برش خورده ي NcSAG1

و پلاسميد  pET-28a………………………….. 67

جدول6-3 : ترکيبات به کار رفته در واکنش PCR با استفاده از پرايمرهاي₇ T…………………………….. 67

جدول۷- ۳: تركيب مواد در واكنش هاي استاندارد…. 73

جدول۸- ۳ : تركيب مواد در واكنش نمونه پروتئين نوترکيب  NcSAG1   74

جدول۹- ۴: نتايج حاصل از درجه تطابق دو تست  LATو الايزا در سه زمان

 2، 3 و 4 دقيقه و در دو غلظت 05/0 و 06/0 ميلي گرم در ميلي ليتر………………………………………. 96

جدول ۱۰- ۴: .نتايج درجه تطابق دو تست  LATو الايزا با استفاده از

 نرم افزار WinEpiscope 2.0 …………………… 96

فهرست شکل ها

عنوان                                         صفحه

شکل 1-2: سير تكاملي نئوسپورا کانينوم………. 10

شکل 2-2- مراحل زندگي نئوسپورا کانينوم در سگ… 11

شکل 3-2- انتقال نئوسپوروزيس در گاو………… 19

شکل 4-2- مقاطع بافت شناسي جفت گاو 14 روز پس از تلقيح داخل وريدي (A,D)

و 28 روز پس از تلقيح زيرجلدي (B,C) با تاکي زوئيت هاي نئوسپورا کانينوم ………………………………… 29

شکل 5-2- مقطع بافت شناسي از مغز جنين گاو (در 84 روزگي آبستني) 14 روز

پس از آلوده کردن مادر با تاکي زوئيت هاي نئوسپورا کانينوم     29

شکل 6-2- آنسفالوميليت ناشي از نئوسپورا کانينوم در جنين و گوساله هايي که

 به صورت طبيعي آلوده شده اند……………… 30

شکل 7-2- نکروز و ضايعات التهابي در جنين گاو… 30

شکل 8-2: نمودار پلي استيرن ذرات لاتکس. …….. 44

شکل 9-2: حالات مختلف نتيجه واکنش آنتي ژن- آنتي بادي در نسبت هاي

 مختلف از غلظتهاي آنتي ژن- آنتي بادي………. 46

شکل ۱-۴: ستون هاي ۱ و ۲ نشانگر محصول PCR با ااستفاده از پرايمرهاي

  NeoNCOFو NeoHindRDNA …………………….. 81

شکل ۲-۴: نتيجه PCR بر روي کولوني ها با استفاده از پرايمرهاي M₁₃. ………………………………………. 82

شکل۳-۴: الکتروفورز نمونه ي حاصل از استخراج پلاسميد از کلون 2163 E.coli GM

حاوي قطعه ژني مورد نظر در پلاسميد pTZ57R/T. …… 83

شکل ۴-۴: نتايج الکتروفورز نمونه هاي حاصل از برش پلاسميد pTZ57R/T حاوي

 قطعه ژني NcSAG1…………………………. 84

شکل ۵-۴: نتايج الکتروفورز نمونه هاي حاصل از برش قطعه ژني NcSAG1 ………………………………………. 85

شکل ۶-۴: نتايج الکتروفورز نمونه هاي خالص سازي شده حاصل از برش

 قطعه ژني NcSAG1 ………………………… 86

عنوان                                         صفحه

شکل ۷-۴: نتايج الکتروفورز نمونه هاي حاصل از PCR با پرايمرهاي

 T7 promoter وterminator T7 برروي کلوني ………….. 87

شکل ۸-۴: الکتروفورز پروتئين NcSAG1بيان شده در دما ي ۲۵ درجه سانتيگراد……………………………………….. 88

شکل ۹-۴: الکتروفورز پروتئين NcSAG1 بيان شده در دماي ۲۸ درجه سانتيگراد. ………………………………………. 89

شکل ۱۰-۴: الکتروفورز پروتئين NcSAG1 بيان شده در دما ي ۳۰ درجه سانتيگراد. …………………………….. 89

شکل ۱۱-۴: الکتروفورز پروتئين NcSAG1 بيان شده در دما ي ۳۲ درجه سانتيگراد………………………………. 90

شکل ۱۲-۴: الکتروفورز پروتئين NcSAG1 بيان شده در دماي ۳۷ درجه سانتيگراد………………………………. 90

شکل ۱۳-۴: الكتروفورز مراحل مختلف خالص سازي پروتئين نوترکيب 91

شکل ۱۴-۴: الكتروفورز مراحل مختلف خالص سازي پروتئين نوترکيب 92

شکل ۱۵-۴: الكتروفورز مراحل مختلف خالص سازي پروتئين نوترکيب 92

شکل ۱۶-۴: الكتروفورز مراحل مختلف خالص سازي پروتئين نوترکيب 93

شکل ۱۷-۴: وسترن بلاتينگ پروتئين نوترکيب خالص شده. 94

شکل ۱۸-۴: الکتروفورز و وسترن بلاتينگ پروتئين نوترکيب بازتاخورده……………………………………….. 95