توسعه تست آویدیته الایزا با استفاده از پروتئینهای نوترکیب برای تمایز عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسما

                       فهرست مطالب               

عنوان                                                                                                                صفحه                                 

چکیده                                                                                                                                       1

مقدمه                                                                                                                                       3       

فصل اول: کلیات

1-1- اتصال ونفوذ توکسوپلاسما گوندی به سلول………………………………………………………………………..           12

1-2-راه انتقال                                                                                                   13

1-2-1-مصرف مواد انگل آلوده به اووسیست………………………………………………………………………………           14

1-2-2-مصرف گوشت حاوی کیست نسجی………………………………………………………………………………..           15

1-2-3-انتقال از طریق جفت  ……………………………………………………………………………………………………..           15

1-3- همه گیر شناسی عفونت توکسوپلاسمایی………………………………………………………………………….           16

1-3-1-عوامل موثر در همه گیر شناسی توکسوپلاسما گوندی………………………………………………….           18

1-3-1-1-عوامل مربوط به انگل…………………………………………………………………………………………………..           18

1-3-1-2-عوامل مربوط به میزبان………………………………………………………………………………………………..           18

1-3-1-3-عوامل مربوط به محیط………………………………………………………………………………………………..           19

1-4-آنتي ژنهاي توكسوپلاسما گوندي………………………………………………………………………………………….           19

1-5-واکسیناسیون                                                                                                                    21

1-6-بیماریزایی                                                                                                  22

1-7-توکسوپلاسموزیس مادرزادی…………………………………………………………………………………………………           24

1-8-تظاهرات بالینی …………………………………………………………………………………………………………………….           25

1-9-تشخیص توکسوپلاسموز………………………………………………………………………………………………………..           29

1-9-1- تشخیص مستقیم…………………………………………………………………………………………………………….             29

1-9-1-1-تشخیص هیستولوژی (بافت شناسی…………………………………………………………………………..             29

1-9-1-2- جداسازی توکسوپلاسما گوندی…………………………………………………………………………………             30

1-9-1-3-تکنیک واکنش زنجیری پلیمراز (PCR1-15-2-تشخیص غیر مستقیم………………..             30

1-9-2-تشخیص غیر مستقیم ………………………………………………………………………………………………………            31

1-9-2-1- تست رنگی سابین – فلدمن………………………………………………………………………………………             34

1-9-2-2- سنجش آنتی بادی فلوئورسنت غیر مستقیم……………………………………………………………             34

1-9-2-3- تست سنجش آگلوتیناسین ایمنوسوربنت………………………………………………………………..             35

1-10-الایزا (ELISA)…………………………………………………………………………………………………………………..             35

1-10-1- الایزای مستقیم ……………………………………………………………………………………………………………             36

1-10-2- الایزای غیر مستقیم……………………………………………………………………………………………………..             36

1-10-3- الایزای ساندویچ…………………………………………………………………………………………………………….             37

1-10-3-1-الایزای ساندویچ مستقیم…………………………………………………………………………………………..             37

1-10-3-2-الایزای ساندویچ غیر مستقیم…………………………………………………………………………………..             37

1-10-4- الایزای رقابتی یا مهاری………………………………………………………………………………………………..             37

1-11-کاربرد پروتئین های نوترکیب در تشخیص توکسوپلاسماَ………………………………………………..             38

1-12-تولید پروتئین نوترکیب………………………………………………………………………………………………………             39

1-13-تشخیص سرولوژی توکسوپلاسموزیس در دوران حاملگی……………………………………………….             39

1-14-ارزش تشخیصی ایزوتایپ های مختلف ایمونوگلوبولین

اختصاصی توکسوپلاسما در تشخیص عفونت………………………………………………………………………………..             40

1-15-کاربرد IgGAvidity در افتراق عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسموزیس……………………….             42

1-16-درمان                                                                                                       44

1-17-پیشگیری                                                                                                   47

1-18- بيان مسئله و اهميت آن……………………………………………………………………………………………………             48

1-19- دلايل انتخاب موضوع ……………………………………………………………………………………………………….             50

1-20-اهداف و فرضيا ت ……………………………………………………………………………………………………………..             51

فصل دوم: مروری بر تحقیقات گذشته                             

2-1- مروری بر تحقیقات گذشته ………………………………………………………………………………………………………………  53

فصل سوم: مواد و روشها

3-1- تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی …………………………………………………………………             59

3-1-1-مکانیسم تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی……………………………………………….             59

3-1-2- تهيه و تخليص پروتئين هاي  نو تركيب rGRA7 (pUET-GRA7) و

rGRA6(PUET-GRA6 ………………………………………………………………………………………………………………             60

3-2- بررسی و تائید پروتئین های تخلیص شده…………………………………………………………………………             62

3-2-1- بررسی و تائید پروتئین های نوترکیب GRA7 و GRA6 بوسیله آنالیز SDS-PAGE             62

3-2-2- تائيد هويت پروتئين بيان شده با روش وسترن بلات……………………………………………………            66

3-3- دیالیز نمونه های تخلیص شده…………………………………………………………………………………………….             71

3-4- تعيين غلظت پروتئين………………………………………………………………………………………………………….             71

3-5- سیستم های الایزا(اصول کار) …………………………………………………………………………………………….             71

3-5-1- طراحی سیستم های الایزا………………………………………………………………………………………………             72

3-5-1-1- نکات تکنیکی در الایزا………………………………………………………………………………………………..             72

3-5-1-2- برخی مشکلات در الایزا……………………………………………………………………………………………..             74

3-6- بررسی پتانسیل PUET-GRA7 و PUET-GRA6 در تشخیص عفونت حاد و مزمن ….

توکسوپلاسموز با روش الایزا…………………………………………………………………………………………………………..             76

3-6-1-برقراری شرایط الایزا…………………………………………………………………………………………………………             76

3-6-2- استفاده از لیزات باکتری در الایزا      ………………………………………………………………………….             76

3-7- اندازه گیری میزان آنتی بادی به روش الایزای غیر مستقیم     …………………………………….             77

3-8-تعیین Cut off  در روش الایزا ……………………………………………………………………………………………             80

3-9- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgG با کیت تجاری Euroimmun ………………………………….             81

3-10- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgM با کیت تجاری Euroimmun ……………………………….             82

3-11- برقراری شرایط بهینه به منظور محاسبه Avidity Index IgG ………………………………….             82

3-12- اندازه گیری IgG Avidity Index  با استفاده از پروتئین های نوترکیب PUET-GRA7 و

 PUET-GRA6                                                                                                   83

3-13- اندازه گیری IgG Avidity Index  با استفاده از کیت تجاری EUROIMMUN  ……             83

3-14- اندازه گیری IgG Avidity Index  با استفاده از کیت تجاری Microgen………………….             85

3-15- محاسبه اندکس اویدیته نسبی (RAI) Relative avidity Index ……………………………….             88

3-16- کنترل کیفی ……………………………………………………………………………………………………………………..             88

3-16-1- حساسیت ……………………………………………………………………………………………………………………..             88

3-17-طراحی تحقیق     ……………………………………………………………………………………………………………..             88

3-18- تعداد نمونه و روش نمونه گیری  ……………………………………………………………………………………             89

3-18-1- تعداد نمونه …………………………………………………………………………………………………………………..             89

3-18-2- روش نمونه گیری………………………………………………………………………………………………………….             89

فصل چهارم: نتایج آزمایشات

4-1 :تهيه و تخليص پروتئين هاي  نو تركيب rGRA7 (pUET-GRA7 و rGRA6

(PUET-GRA6                                                                                                   92

4-2- تایید هویت پروتئین های تخلیص شده با روش وسترن بلات ………………………………………..             93

4-3- بررسیIgG,IgM,IgG Avidity نمونه های سرمی با کیت استاندارد Euroimmun                 94

4-3-1- نتیجه آزمایشات IgG ELISA  مخصوص توکسوپلاسما سرمهای

ایرانی با کیت Euroimmun…………………………………………………………………………………………………………… .           95

4-3-2- نتیجه آزمایشات IgM ELISA  مخصوص توکسوپلاسما سرمهای با کیت Euroimmun        95

4-3-3-نتیجه آزمایشات IgG Avidity ELISA  مخصوص توکسوپلاسما سرم ها

با کیت Euroimmun  ……………………………………………………………………………………………………………………            96

4-4- برقراری شرایط ELISA  Avidity با پروتئین های نوترکیب  ………………………………………..           100

4-5- نتایج آزمایش Avidity ELISA  با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA6 برای تمایز

 عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار………………………………………………………………………………..           103

4-6- نتایج آزمایش Avidity ELISA  با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA7 برای تمایز

عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار ایران  ……………………………………………………………………..           103

4-7- بررسی نتایج ناهمخوان بین الایزا اویدیته با پروتئین های GRA6 وGRA7 و کیت

 Euroimmun با استفاده از کیت Microgen……………………………………………………………………………….           104

فصل پنجم:بحث، پیشنهادات

منابع                                                                                                                                       121

خلاصه انگلیسی   …………………………………………………………………………………………            127

ضمائم                                                                                                                                      129

فهرست جداول

عنوان                                                                                                                   صفحه

جدول3-1: جدول ارزیابی اویدیتی در کیت میکروژن…………………………………………………………………            87

جدول 4-1: نتایج آزمایشات Avidity ELISA,IgG,IgM سرم ها با کیت Euroimmon………            97

جدول 4-2: بررسی نتایج ناهم خوان با کیت های Microgen,Euroimmun و پروتئین های

 GRA6 وGRA7     …………………………………………………………………………………………………………………….           106

جدول شماره 4-3: نتایج آزمایش IgG وIgG Avidity با پروتئین های GRA6 و GRA7

 بر روی سرم های زنان باردار ………………………………………………………………………………………………… ….. 108

فهرست شکل ها

عنوان                                                                                                                   صفحه

شکل1-1- شكل شماتیك یك تاكی زوایت و یك برادی زوایت توكسوپلاسما گوندی ……………              4

شکل1-2- عكس میكروسكوپ الكترونی یك تاكی زوایت، سوش  VEGكه در حال

نفوذ به یك نوتروفیل صفاق موش می باشد………………………………………………………………………………….              7

شکل1-3- عکس میکروسکوپ الکترونی از تاکی زوایت سوش VEG در حال تقسیم

اندودیوژنی داخل ماکروفاژ صفاق موش…………………………………………………………………………………………              8

شکل1-4- یك كیست بافتی توكسوپلاسما كه حاوی بیش از هزار برادی زوایت می باشد…….              9

شکل 1-5- راه های انتقال انگل توکسوپلاسما گوندی در میزبان اصلی و حد واسط……………….             16

شکل 1-6- دختری با هیدروانسفالی بعلت توکسوپلاسموز مادرزادی…………………………………………            25

شکل 1-7- شکل شماتیک انواع الایزا………………………………………………………………………………………….             38

شکل3-1:نوارهای کیت میکروژن…………………………………………………………………………………………………..             87

شکل 4-1  : تخلیص پروتئین GRA6 به روش کروماتوگرافی تمایلی ……………………………………..             92

شکل 4-2: تخلیص پروتئین GRA7 به روش کروماتوگرافی تمایلی …………………………………………             93

شکل 4-3: بررسی هویت آنتی ژنیسته پروتئین های GRA6 وGRA7

تخلیص شده باروش وسترن بلات ………………………………………………………………………………………………..             94

شکل 4-4 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما

 در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6 …………………………………………………………………………           101

شکل 4-5 :  تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن

 عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6……………………………………….           101

شکل 4-6 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما

 در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7…………………………………………………………………………..           102

شکل 4-7 :  تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن

عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7………………………………………..           102

شکل4-8: مدلی از بلوغ آنتی بادی های IgG به آنتی ژن های توکسوپلاسمای……………………….           105

شکل 4-9: نتایج کیت میکروژن…………………………………………………………………………………………………………………. 106

شکل4-10: مقایسه اجرای تست Avidity با کیت Euroimmun و پروتئین GRA6 برای افتراق

 عفونت حاد و مزمن و تحت حاد…………………………………………………………………………………………………..           107