%53تخفیف

تراریختی گیاه کلزا (Brassica napus L.) با استفاده از Agrobacterium tumefaciens حاوی ژن espA-eae تحت کنترل پروموتر بذر- ویژه ی FAE

Name: تراریختی گیاه کلزا (Brassica napus L.) با استفاده از Agrobacterium tumefaciens حاوی ژن espA-eae تحت کنترل پروموتر بذر- ویژه ی FAE
SKU: 9990
Availability: InStock

تعداد128صفحه در فایل word

گیاه کلزا (Brassica napus L.) جزء یکی از سه گیاه تولید کننده ی روغن جهان می باشد. به دلیل کشت انبوه این گیاه و ویژگی های اقتصادی آن ایجاد خصوصیات جدید در این گیاه امکان کشت چند منظوره ی آن را فراهم می آورد. باکتری Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 یکی از خطرناک ترین باکتری های جنسEscherichia می باشد و باعث بیماری کولیت هموراژیک و سندرم همولیتیک اورومیک در انسان می شود. این باکتری پس از ورود به بدن در ابتدا با تولید پروتئین های EspA، EspB، EspD، Tir و اینتیمین به سطوح اپی تلیال چسبیده و فرآیند بیماریزایی خود را شروع می کند. هدف این تحقیق ایجاد گیاه تراریخت جهت تولید عوامل بیماریزای EspA:Intimin به صورت کایمریک به عنوان کاندیدای واکسن علیه E.coli O157:H7 می باشد. ژن سنتتیک EI که کد کننده ی پروتئین های EspA و اینتیمین است جهت انتقال به گیاه مورد استفاده قرار گرفت. بدین منظور ابتدا کشت بافت گیاه کلزا با استفاده از هورمون بنزیل آدنین و نفتالین استیک اسید بهینه شد. سپس به وسیله آگروباکتریوم فرآیند تراریختی نیز با استفاده از دو روش سنتی و چاهک بهینه شد. ژن EI به وسیله ی Agrobacterium tumefaciens به گیاه کلزا منتقل شد. این ژن تحت کنترل پروموتر بذر- ویژه ی FAE بود. جداکشت های برگ های لپه ای پس از آغشتگی با سوسپانسیون آگروباکتریوم به ترتیب در محیط همکشتی، محیط های انتخابی القای شاخه زایی حاوی هورمون mg l^-1 3 هورمون بنزیل آدنین و محیط بلوغ شاخه ی فاقد هورمون و نهایتاً محیط ریشه زایی حاوی mg l^-1 1 هورمون نفتالین استیک اسید کشت شدند. گیاهان سبز مقاوم به آنتی بیوتیک در محیط انتخابی به گلدان های خاک و ورمیکولیت منتقل شدند. از گیاهان تراریخت DNA ژنومی استخراج شد و واکنش زنجیره ای پلیمرازی به منظور تایید ورود ژن EI به گیاه انجام گرفت. این مطالعه نشان دهنده ی آینده ای امید بخش برای استفاده از گیاهان تراریخت به عنوان بیوراکتور جهت تولید پروتئین و واکسن های نوترکیب می باشد.

واژگان کلیدی: کلزا، آگروباکتریوم، اینتیمین، کوتیلدون، باززایی

دسته: زیست شناسی, علوم تجربی برچسب: آگروباکتریوم, اینتیمین, باززایی, کوتیلدون, واژگان کلیدی: کلزا

توضیحات

عنوان صفحه

فصل اول : مقدمه ……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 1

1-1 گیاه شناسی کلزا ………………………………………………………………………………………………………………………………….. 1

1-2 تاریخچه کلزا ………………………………………………………………………………………………………………………………………… 3

1-3 اهمیت اقتصادی گیاه کلزا …………………………………………………………………………………………………………………… 4

1-4 انتروباکتریاسه ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 5

1-4-1 Escherichia coli ……………………………………………………………………………………………………………………… 6

1-4-2 طبقه بندی Escherichia coli بر اساس بیماری زایی ……………………………………………………………… 7

1-4-3 Enterohemorrhagc Escherichia coli …………………………………………………………………………………… 8

1-4-4 مکانیسم بیماریزایی EHEC O157:H7 ……………………………………………………………………………………. 9

1-5 روش های تراریختی ژنی در گیاهان …………………………………………………………………………………………………… 9

1-6 ژن گزارشگر GUS ……………………………………………………………………………………………………………………………… 18

1-7 تولید گیاهان تراریخت ………………………………………………………………………………………………………………………. 18

1-7-1 تاریخچه تراریختی ژنی در گونه های Brassica ……………………………………………………………………. 19

1-8 بیان آنتی ژن و واکسن در گیاه تراریخت …………………………………………………………………………………………. 20

1-9 ملاحظات تکنیکی در تولید پروتئین نوترکیب …………………………………………………………………………………. 23

1-9-1 انتخاب پروموتر ……………………………………………………………………………………………………………………….. 24

1-9-2 فاکتورهای مؤثر در پایداری mRNA و افزایش ترجمه ………………………………………………………….. 26

1-9-3 پایداری پروتئین و تجمع آن در میزبان های گیاهی …………………………………………………………….. 27

1-10 مطالعات تولید واکسن علیه EHEC در گیاهان تراریخت ………………………………………………………………. 28

1-11 هدف اجرای تحقیق ………………………………………………………………………………………………………………………… 29

1-12 فرضیه تحقیق …………………………………………………………………………………………………………………………………. 29

فصل دوم: مواد و روش ها ……………………………………………………………………………….. 30

2-1 مواد مورد نیاز ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 31

2-1-1 سویه باکتری …………………………………………………………………………………………………………………………… 31

2-1-2 پلاسمید ………………………………………………………………………………………………………………………………….. 31

2-1-3 بذور گیاهی …………………………………………………………………………………………………………………………….. 31

2-1-4 محیط های کشت گیاهی ………………………………………………………………………………………………………. 32

2-1-5 هورمون های گیاهی ………………………………………………………………………………………………………………. 32

2-1-6 آنتی بیوتیک ها ………………………………………………………………………………………………………………………. 32

2-1-7 کیت استخراج DNA ……………………………………………………………………………………………………………… 33

2-2 روش ها ……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 33

2-2-1 ساخت انواع محیط های کشت گیاهی مورد نیاز …………………………………………………………………… 33

2-2-1-1 نحوه ساخت محلول های ذخیره ………………………………………………………………………………… 33

2-2-1-1-5 محلول ذخیره ی هورمون 6- بنزیل آدنین (BA) …………………………………………… 36

2-2-1-1-6 محلول ذخیره ی هورمون نفتالین استیک اسید (NAA) ……………………………….. 36

2-2-1-1-7 محلول ذخیره ی هورمون 2,4-D …………………………………………………………………….. 36

2-2-1-1-8 محلول ذخیره ی آنتی بیوتیک ………………………………………………………………………… 36

2-2-2 ساخت محیط Luria-Bertani (LB) جهت کشت آگروباکتریوم ……………………………………………. 37

2-2-3 محیط های کشت MS و B5 …………………………………………………………………………………………………. 37

2-2-4 سازه ژنی EI ………………………………………………………………………………………………………………………….. 38

2-2-5 کشت بافت و تراریختی گیاه ………………………………………………………………………………………………….. 38

2-2-5-1 بهینه سازی کشت بافت گیاه کلزا ………………………………………………………………………………. 38

2-2-5-2 شرایط کشت آگروباکتریوم ………………………………………………………………………………………….. 39

2-2-5-3 تراریختی جداکشت های برگ های لپه ای ………………………………………………………………… 40

2-2-6 آزمون بافت شیمیایی GUS …………………………………………………………………………………………………… 41

2-2-7 استخراج DNA ……………………………………………………………………………………………………………………….. 41

2-2-8 تایید تراریختی گیاهان از طریق PCR …………………………………………………………………………………… 42

2-2-8-1 طراحی آغازگر ……………………………………………………………………………………………………………… 42

2-2-8-2 الكتروفورز محصولات PCR …………………………………………………………………………………………. 44

فصل سوم: نتایج ……………………………………………………………………………………………. 47

3-1 باززایی جداکشت های محور زیر لپه ………………………………………………………………………………………………… 48

3-2 باززایی جداکشت های برگ های لپه ای ………………………………………………………………………………………….. 51

3-3 تراریختی گیاهان با استفاده از آگروباکتریوم …………………………………………………………………………………… 53

3-3-1 آغشتگی و همکشتی آگروباکتریوم با جداکشت های گیاهی ………………………………………………… 53

3-4 تایید انتقال ژن GUS به وسیله ی PCR ………………………………………………………………………………………….. 56

3-5 آزمون GUS ……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 56

3-6 بررسی سیتوهیستولوژیکی بیان ژن GUS ………………………………………………………………………………………… 57

3-7 آنالیز مولکولی گیاهان تراریخت ………………………………………………………………………………………………………… 57

3-7-1 استخراج DNA ژنومی از گیاهان تراریخت ……………………………………………………………………………. 57

3-7-2 آزمون PCR ژن EI …………………………………………………………………………………………………………………. 57

فصل چهارم: بحث و تفسیر …………………………………………………………………………….. 74

بحث …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 75

پیشنهادات …………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 86

منابع …………………………………………………………………………………………………………….. 87

اشکال

شکل (1-1) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….12

شکل (3-1) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….59

شکل (3-2) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….59

شکل (3-3) ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………60

شکل (3-4) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….60

شکل (3-5) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….61

شکل (3-6) ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..61

شکل (3-7) ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………62

شکل (3-8) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….63

شکل (3-9) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….63

شکل (3-10) ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….64

شکل (3-11) ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….64

شکل (3-12) ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….65

شکل (3-13) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………66

شکل (3-14) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………66

شکل (3-15) ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….67

شکل (3-16) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………67

شکل (3-17) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………68

شکل (3-18) ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….68

شکل (3-19) ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….69

شکل (3-20) ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….70

شکل (3-21) ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….71

شکل (3-22) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………71

شکل (3-23) ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….72

شکل (3-24) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………73

شکل (3-25) ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….73

جداول

جدول (2-1) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..44

جدول (2-2) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..44

جدول (3-1) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..58

جدول (3-2) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..58