تاثیر انجماد شیشه ای و تکوین در محیط کشت بر روی پراکندگی میتوکندری و میزان ATP جنین های موش در مراحل 2-PN و 4سلولی و بلاستوسیست

فهرست مطالب

فصل اول: مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته………… 1

1-1. مقدمه………………………………….. 2

1-2. انجماد شیشه­ای…………………………… 4

1-3. انجماد شیشه­ای جنین و پیشرفتهای نوین در آن….. 4

1-3-1. بهبود روش انجماد شیشه­ای با محلولهای ضد یخ مختلف   4

1-3-2. بهبود روش انجماد شیشه­ای و تغییرات دمایی و زمانهای تعادل مختلف………………………………………. 8

1-3-3. بهبود روش انجماد شیشه­ای با سیستم های مختلف Carrier   9

1-3-4. انجماد جنین در مراحل مختلف تکوین جنینی…… 16

1-4. میتوکندری در جنین مراحل قبل از لانه گزینی…… 21

1-4-1. ساختمان میتوکندری جنین…………………. 21

1-4-2.  عملکرد میتوکندری جنین…………………. 23

1-4-3. تفاوتهای تولید ATP در مراحل مختلف تکوین جنین 24

1-4-4. تعداد میتوکندری و استقرار آن در جنین مراحل مختلف تکوینی…………………………………………… 28

1-4-5. تأثیر انجماد بر میتوکندری………………. 31

1-4-6. تأثیر کشت جنین بر میتوکندری آن………….. 34

1-5. اهداف………………………………….. 37

1-6. فرضيه ها/ پيش فرض ها ……………………. 37

فصل دوم: مواد و روش­ها­………………………… 39

2-1. تهيه جنين………………………………. 40

2-1-1. محيط كشت……………………………… 40

2-2-1. انجماد شيشه‌اي…………………………. 41

2-2-1-1. ابزار مورد نياز……………………… 41

2-2-1-2. محلولهاي مورد نياز…………………… 41

2-2-1-2-1. محلول تعادل……………………….. 41

2-2-1-2- 2. محلول انجمادي…………………….. 42

2-2-1-2-3. تهيه محلولهاي ذوب………………….. 42

2-3. تست سميت……………………………….. 43

2-4. روش انجماد شيشه‌اي……………………….. 43

2-5. مراحل اصلی تحقیق………………………… 45

2-5-1. بررسی تکوین جنینها…………………….. 45

2-5-2. روش اندازه‌گيري ميزان ATP……………….. 46

2-5-2-1. وسايل مورد نياز براي اندازه‌گيري ميزان ATP. 46

2-5-2-2. اجزاء محلول كمپلكس بدون ATP…………… 47

2-5-2-3. روش كار…………………………….. 47

2-5-2-3-1. تعيين منحني استاندارد………………. 47

2-5-2-3-2. آماده سازي جنينها براي اندازه‌گيري ATP… 48

2-5-2-3-3. اندازه‌گيري ميزان ATP جنينها…………. 48

2-5-3. رنگ‌آميزي ميتوكندري…………………….. 49

2-5-3-1. ساخت محلول Mitotracker green………………… 49

2-5-3-2. آماده‌سازي سلول براي رنگ‌آميزي با Mitotracker green 50

2-6. آنالیز آماری……………………………. 50

فصل سوم: نتایج و یافته­ها……………………… 51

3-1. ارزيابي نتايج آزمايش سميت………………… 52

3-2. ارزيابي ميزان بقا جنينها پس از انجماد شيشه‌اي و ذوب  52

3-3. ارزيابي ميزان تكوين جنين‌هاي موش در مراحل تكويني مختلف در محيط‌هاي كشت مختلف……………………………. 53

3-4.ارزيابي ميزان تكوين جنينهاي 2-PN در دو گروه كنترل و انجماد شيشه‌اي……………………………………… 53

3-5. ارزيابي ميزان تكوين جنينهاي 4 سلولي در گروه كنترل و انجماد شيشه‌اي……………………………………… 54

3-6. ارزيابي ميزان تكوين جنينهاي early blastocyst در دو گروه كنترل و انجماد شيشه‌اي……………………………….. 54

3-7. مقايسه ميزان تشكيل بلاستوسيست در جنينهاي مراحل 2-PN و 4 سلولي در گروه كنترل……………………………….. 54

3-8. مقايسه ميزان خروج از زونا در جنين‌هاي مراحل مختلف تكويني در گروه كنترل………………………………….. 55

3-9. مقايسه ميزان تشكيل بلاستوسيست در جنينهاي مراحل 2-PN و 4 سلولي در گروه انجمادي……………………………… 55

3-10. مقايسه ميزان خروج از زونا در جنين‌هاي مراحل مختلف تكويني در گروه انجمادي………………………………… 55

3-11. ارزيابي ميزان ATP در جنين‌هاي مراحل مختلف تكويني    56

3-11-1. ارزيابي ميزان ATP در جنينهاي مرحله 2-PN در گروه كنترل و انجمادي…………………………………….. 56

3-11-2. ارزيابي ميزان ATP در جنين‌هاي مرحله 4 سلولي در بخش in vivo در گروه كنترل و انجمادي…………………………. 56

3-11-3. ارزيابي ميزان ATP در جنين‌هاي مرحله 4 سلولي در بخش in vitro در گروه كنترل و انجمادي…………………………. 56

3-11-4. مقايسه ميزان ATP جنين‌هاي 4 سلولي in vivo و in vitro در گروه كنترل…………………………………………… 57

3-11-5. مقايسه ميزان ATP جنين‌هاي 4 سلولي invivo و invitro در گروه انجمادي…………………………………………… 57

3-11-6. ارزيابي ميزان ATP در جنين‌هاي مرحله early blastocyst در بخش in vivo در گروه كنترل و انجمادي………………………. 57

3-11-7. ارزيابي ميزان ATP در جنين‌هاي مرحله early blastocyst كشت شده از مرحله 2-PN (in vitro) در گروه كنترل و انجمادي………… 58

3-11-8. ارزيابي ميزان ATP در جنين‌هاي مرحله early blastocyst در بخش in vitro (كشت شده از مرحله 4 سلولي) در گروه كنترل و انجمادی. 58

3-11-9. مقايسه ميزان ATP جنين‌هاي early blastocyst در بخش invivo و invitro (كشت شده از مرحله 2-PN و 4 سلولي) در گروه كنترل………. 58

3-11-10. مقايسه ميزان ATP جنين‌هاي early blastocyst در بخش in vivo و in vitro (كشت شده از مرحله 2-PN و 4 سلولي) در گروه انجمادي… 59

3-12. ارزیابی توزیع میتوکندری جنینهای مرحله 2-PN در گروه کنترل و انجمادی…………………………………….. 59

3-13. ارزیابی توزیع میتوکندری جنینهای مرحله 4 سلولی در گروه کنترل و انجمادی…………………………………… 59

 فصل چهارم: بحث، نتیجه گیری و پیشنهادات……….. 70

4-1. بحث……………………………………. 71

4-2. نتیجه گیری……………………………… 79

4-3. پیشنهادات………………………………. 79

فهرست منابع…………………………………. 80

چکیده انگلیسی……………………………….. 105

فهرست جداول

جدول 3-1. میزان زنده ماندن جنینهای موش در مراحل مختلف تکوینی پس از انجام تست سمیت …………………………… 60

جدول 3-2. ميزان زنده‌ ماندن جنينهاي موش در مراحل مختلف تكويني پس از انجماد شيشه‌اي و ذوب……………………….. 60

جدول 3-3. ميزان تكوين جنين‌هاي موش در مراحل تكويني مختلف در محيط‌هاي كشت مختلف (pilot study)…………………………… 61

جدول 3-4. میزان تکوین جنینهای موش در مرحله 2-PN در گروههای کنترل و انجمادی تا 120 ساعت………………………….. 62

جدول 3-5. میزان تکوین جنینهای موش در مرحله 4 سلولی در گروههای کنترل و انجمادی تا 72 ساعت……………………. 63

جدول 3-6. میزان تکوین جنینهای موش در مرحله early Blastocyst در گروههای کنترل و انجمادی تا 24 ساعت……………………. 64

جدول 3-7. ميزان ATP در مراحل مختلف تكويني 2-PN، 4 سلولي و early blastocyst در دو بخش in vivo و in vitro در گروه كنترل و انجمادي….. 65

فهرست شکل ها

شکل 3-1. جنین موش در مرحله 2-PN گروه کنترل رنگ آمیزی شده با Mitotracker Green……………………………………….. 66

شکل 3-2. جنین موش در مرحله 2-PN انجمادی رنگ آمیزی شده با Mitotracker Green……………………………………….. 67

شکل 3-3. جنین موش در مرحله 4 سلولی گروه کنترل رنگ آمیزی شده با Mitotracker Green…………………………………. 68

شکل 3-4. جنین موش در مرحله 4 سلولی انجمادی رنگ آمیزی شده با Mitotracker Green……………………………………….. 69