بررسی مولکولی و بيوشيميايی الگوی مقاومت آنتی بيوتيکی مرتبط با اينتگرون ها در ايزوله های اشريشيا کلای جدا شده از منابع   انسانی و حيوانی

فهرست عناوین

                                                                                                                                                                                                                                                                                              عنوان                                                                                                                   صفحه

خلاصه فارسی…………………………………………………………………………………………………… 1

مقدمه……………………………………………………………………………………………………………… 2

فصل اول: کلیات……………………………………………………………………………………………….. 5

1-1-کلیات و تاریخچه……………………………………………………………………………………….. 6

1-2- طبقه بندی اشریشیا کلای………………………………………………………………………………. 7

1-3- مورفولوژی و فیزیولوژی……………………………………………………………………………….. 9

1-4- ساختار آنتی ژنی و شاخص های بیماریزایی………………………………………………………. 10

1-4-1- میکروکپسول…………………………………………………………………………………………. 10

1-4-2- فیمبریه (پیلی)………………………………………………………………………………………… 10

1-5- اگزوتوکسین ها………………………………………………………………………………………….. 11

1-5-1-توکسین های Stx-1 و Stx-2 و وروتوکسین (Vtx)……………………………………….. 11

1-6- انتروتوکسین……………………………………………………………………………………………… 12

1-7- عوامل اتصال…………………………………………………………………………………………….. 13

1-8- پاتوتایپ های اشریشیا کلای …………………………………………………………………………. 15

1-9- علائم بالینی و بیماری ها………………………………………………………………………………. 16

1-9-1-گاستروانتریت…………………………………………………………………………………………. 16

1-9-2- بیماری های ناشی از EPEC…………………………………………………………………….. 16

1-9-3- بیماری ناشی از ETEC…………………………………………………………………………… 17

1-9-4- بیماری ناشی از EIEC …………………………………………………………………………… 18

1-9-5- بیماری ناشی از EHEC………………………………………………………………………….. 19

1-9-6- بیماری ناشی از DAEC………………………………………………………………………….. 20

1-9-7- بیماری ناشی از EAEC …………………………………………………………………………. 21

1-9-8- عفونت های دستگاه ادراری……………………………………………………………………….. 21

1-10- مننژیت…………………………………………………………………………………………………… 22

1-11- سپتی سمی……………………………………………………………………………………………… 22

 1-12- تشخیص آزمایشگاهی……………………………………………………………………………….. 24

 1-12-1-کشت………………………………………………………………………………………………… 24

1-12-2- تشخیص بیوشیمیایی………………………………………………………………………………. 25

1-12-3- تقسیم بندی سرولوژیک …………………………………………………………………………. 26

1-13- درمان پیشگیری و کنترل……………………………………………………………………………… 26

1-14- مقاومت دارویی و اهمیت آن در اشریشیا کلای………………………………………………….. 28

1-14-1-تغییر جایگاه هدف…………………………………………………………………………………. 29

1-14-2-تخریب و یا غیر فعال کردن آنتی بیوتیک ها………………………………………………….. 29

1-14-3- ناتراوا شدن نسبت به ورود آنتی بیوتیک به درون سلول باکتری…………………………… 30

1-14-4- میانبر متابولیکی…………………………………………………………………………………….. 30

1-15- ژنتیک مقاومت باکتریایی……………………………………………………………………………. 30

1-15-1- اپیدمیولوژی…………………………………………………………………………………………. 30

1-16- اینتگرون ها و اهمیتشان در ایجاد مقاومت دارویی ………………………………………………. 32

1-16-1- ساختار اینتگرون ها……………………………………………………………………………….. 32

1-16-2- اینتگرون های متحرک……………………………………………………………………………. 34

1-16-3- سوپراینتگرون های کروموزومی…………………………………………………………………. 35

1-16-4- منشأ اینتگرون های متحرک……………………………………………………………………… 36

1-16-5- نحوه قرارگرفتن کاست های ژنی در ساختار اینتگرون ها ………………………………………….36

1-17- مروری بر تحقیقات دیگران………………………………………………………………………….. 37

فصل دوم: مواد و روش ها…………………………………………………………………………………….. 40

2-1- دستگاه ها و وسایل مورد نیاز…………………………………………………………………………. 41

2-2-مواد مصرفی مورد نیاز…………………………………………………………………………………… 43

2-3- محیط های کشت مورد استفاده………………………………………………………………………. 43

2-4- ترکیبات و محلول های مورد نیاز و فرمول ساخت  آن ها ……………………………………………….44

2-4-1- محلول EDTA (5/. مولار)………………………………………………………………………. 44

2-4-2- بافر TBE (5x)……………………………………………………………………………………. 44

2-4-3- بافرTE(Tris EDTA)………………………………………………………………………….. 44

2-5- روش مطالعه و اجرای پروژه…………………………………………………………………………… 44

2-5-1- نوع مطالعه…………………………………………………………………………………………….. 44

2-5-2- جمع آوری نمونه ها………………………………………………………………………………… 45

2-6- روش انجام پروژه……………………………………………………………………………………….. 45

2-6-1- روش های باکتری شناسی…………………………………………………………………………. 45

2-6-2- بررسی حساسیت آنتی بیوتیکی…………………………………………………………………… 46

2-6-3- دیسک گذاری………………………………………………………………………………………. 47

2-7- استخراج، تعيين کميت و کيفيت DNA (به روش ستونی)……………………………………… 47

2-7-1- کشت باکتری ها جهت استخراج ژنوم…………………………………………………………… 47

2-7-2- استخراج DNA…………………………………………………………………………………….. 48

2-7-3-کميت سنجي و غلظت سنجي DNA استخراج شده…………………………………………. 49

2-8- انجام آزمایشات مولکولی……………………………………………………………………………… 50

2-8-1- طراحی پرایمرهای اختصاصی…………………………………………………………………….. 50

2-8-2- بررسي کارايي پرايمرها در محيط مجازي In silico PCR ……………………………………..50

2-8-3- بررسي بر هم کنش بين پرايمرها …………………………………………………………………. 50

2-8-4- رقیق سازی پرایمر ها……………………………………………………………………………….. 51

2-9- مراحل …….PCR………………………………………………………………………………….. 53

2-9-1- مرحله واسرشتي اوليه……………………………………………………………………………….. 53

2-9-2- مرحله واسرشتي……………………………………………………………………………………… 53

2-9-3- مرحله اتصال………………………………………………………………………………………….. 53

2-9-4- مرحله طويل شدن……………………………………………………………………………………. 53

2-9-5- مرحله طويل شدن نهايي……………………………………………………………………………. 53

2-10- ژل الکتروفورز…………………………………………………………………………………………. 54

2-10-1- تصوير برداري از ژل………………………………………………………………………………. 54

2-11- محاسبات آماری و تجزیه و تحلیل داده های بدست آمده…………………………………….. 54

فصل سوم: نتایج………………………………………………………………………………………………… 55

3-1- نتایج کشت، جداسازی و تعیین هویت باکتری ها، حساسیت آنتی بیوتیکی و ………………. 56

3-1-1- نتایج حساسیت آنتی بیوتیکی……………………………………………………………………… 56

3-2- آنالیز  و مقایسه نتایج کل نمونه ها…………………………………………………………………… 82

3-3-بهینه سازی دمایی PCR  برای  شناسایی اینتگرون های کلاس 1 و 2………………………… 82

3-4- انجام آزمون بر روی سایر ایزوله ها………………………………………………………………….. 83

فصل چهارم: بحث و نتیجه گیری……………………………………………………………………………. 86

منابع……………………………………………………………………………………………………………….. 93

خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………….100

فهرست تصاویر

 

 

عنوان                                                                                                                           صفحه

تصویر1-1-  ساختار شیمیایی برخی از آنتی بیوتیک های مورد استفاده در درمان                                      عفونت های E. coli ……………………………………………………………………………………………………………… 28

تصویر1-2- اینتگرون های متحرک و سوپر اینتگرون ها………………………………………………… 34

تصویر1-3- نحوه نوترکیبی در اینتگرون ها……………………………………………………………….. 37

تصویر2-1- نماي شماتيک از مراحل استخراج DNA با استفاده از کیت ستونی…………………. 49

تصویر3-1- الکتروفورز محصولات حاصل در روند بهینه سازی دمایی PCR  برای شناسایی اینتگرون های کلاس 1و2  83

تصویر3-2- الکتروفورز محصولات PCR جهت تشخیص اینتگرون های کلاس 1 و2  …………. 84

تصویر 3-3- الکتروفورز محصولات PCR جهت تشخیص اینتگرون های کلاس 1و2 در ایزوله های جدا شده از مرغ     84

تصویر 3-4- الکتروفورز محصولات PCR جهت تشخیص اینتگرون های کلاس 1و2 در ایزوله های جدا شده از انسان   85

تصویر 3-5- الکتروفورز محصولات PCR جهت تشخیص اینتگرون های کلاس 1و2 در ایزوله های جدا شده از گاو     85

فهرست نمودارها

 

                                                                                                                                        

عنوان                                                                                                                   صفحه

نمودار3-1- مقايسه تعداد ایزوله های ,R  Sو I نبست به سفازولين…………………………………… 69

نمودار3-2- مقایسه تعداد ایزوله های S ,R  و I نسبت به آمپی سیلین……………………………….. 70

نمودار3-3- مقایسه تعداد ایزوله های S, Rو I نسبت به پیپراسیلین …………………………………… 71

نمودار3-4- مقایسه تعداد ایزوله های S, Rو I نسبت به استرپتومایسین………………………………. 72

نمودار 3-5- مقایسه تعداد ایزوله های S , R وI  نسبت به توبرامایسین………………………………. 73

نمودار3-6- مقایسه تعداد ایزوله های S, RوI نسبت به سولفامتوکسازول……………………………. 74

نمودار3-7- مقایسه تعداد ایزوله های S, R و I نسبت به آمیکاسین………………………………….. 75

نمودار3-8- مقایسه تعداد ایزوله های S, Rو I نسبت به   نالیدیکسیک اسید……………………….. 76

نمودار3-9- مقایسه تعداد ایزوله های S, R و I نسبت به جنتامیسین………………………………….. 77

نمودار3-10- مقایسه تعداد ایزوله های S, R و I  نسبت به کانامایسین………………………………. 78

نمودار3-11- مقایسه تعداد ایزوله های S, R و I نسبت به نئومایسین…………………………………. 79

نمودار3-12- مقایسه تعداد ایزوله های واجد و فاقد اینتگرون کلاس 1……………………………….. 80

نمودار3-13- مقایسه تعداد ایزوله های واجد و فاقد اینتگرون کلاس 2……………………………….. 81

فهرست جداول

عنوان                                                                                                                    صفحه

جدول1-1- طبقه بندی علمی اشریشیا کلای………………………………………………………………. 7

جدول1-2- فاکتور های ویرولانس اختصاصی مرتبط با اشریشیا کلای………………………………. 15

جدول 1-3- گاسترو انتریت ناشی از اشریشیا کلای……………………………………………………… 22

جدول1-4- تست های بیوشیمیایی مهم در تشخیص اشریشیا کلای…………………………………… 25

جدول2-1- مشخصات پرايمرهاي مورد استفاده به منظور شناسايی ژن های int…………………… 51

جدول 2-2-  اجزا و غلظت ترکیبات موجود در PCR برای شناسایی اینتگرون های کلاس1…… 51

جدول 2-3-  اجزا و غلظت ترکیبات موجود در PCR برای شناسایی اینتگرون های کلاس2…… 52

جدول 2-4- برنامه دمایی ترموسایکلر جهت انجام PCR  برای شناسایی اینتگرون های                           کلاس 1و2……………………………………………………………………………………………………………………..52

جدول3-1- میزان مقاومت در بین سویه های مختلف اشریشیا کلای………………………………….. 57

جدول 3-2-  مقایسه الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی در ایزوله های جدا شده از منابع مختلف حیوانی و انسانی      64

جدول3-3- مقایسه الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی در ایزوله های واجد و فاقد اینتگرون…………… 68