بررسی مقاومت دارویی و فراوانی ژنهای blaVIM و blaNDM در اسینتوباکتربومانی های ایزوله شده از بیماران شهرتهران

 

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                        صفحه

چکیده………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 1

فصل اول – مقدمه

1-1- بیان مسأله…………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 2

1-2- ضرورت انجام تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………. 3

1-3-اهداف پژوهش…………………………………………………………………………………………………………………………………………… 4

1-4-فرضیه‏ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 4

1-5-تعریف متغیرها…………………………………………………………………………………………………………………………………………… 4

فصل دوم – مروری بر تحقیقات انجام شده

2-1- تاریخچه جنس اسینتوباکتر بومانی…………………………………………………………………………………………………………… 6

2-2- تاکسونومی رایج اسینتوباکتر بومانی………………………………………………………………………………………………………… 7

2-3- شناسایی گونه های اسینتوباکتر……………………………………………………………………………………………………………….. 7

2-4- جایگاه طبیعی اسینتوباکتر بومانی…………………………………………………………………………………………………………….. 8

2-5.فاکتورهای بیماری زایی اسینتوباکتر…………………………………………………………………………………………………………… 8

2-6.منشا کلینیکی عفونت های اسینتوباکتر بومانی………………………………………………………………………………………… 10

2-6-1.مننژیت…………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 10

2-6-2.عفونت خون………………………………………………………………………………………………………………………………………… 10

2-6-3.عفونت های دستگاه ادراری………………………………………………………………………………………………………………… 10

2-6-4. پنومونی بیمارستانی…………………………………………………………………………………………………………………………… 10

2-7. عفونت های بیمارستانی………………………………………………………………………………………………………………………….. 11

2-8. استراتژی های درمانی عفونت های اسینتوباکتر بومانی………………………………………………………………………….. 12

2-9. داروهای ضد میکروبی رایج…………………………………………………………………………………………………………………… 12

2-9-1. پلی میکسین ها………………………………………………………………………………………………………………………………….. 13

2-9-2.آمینوگلیکوزیدها…………………………………………………………………………………………………………………………………. 13

2-9-3.سولباکتام…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 14

2-9-4. کینولون ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 14

2-9-5.تتراسایکلین ها و تایگلیسین ها…………………………………………………………………………………………………………. 15

2-9-6.آنتی بیوتیک های بتالاکتام………………………………………………………………………………………………………………….. 15

2-9-6-1.پنی سیلین ها…………………………………………………………………………………………………………………………………. 15

2-9-6-2.کارباپنم ها……………………………………………………………………………………………………………………………………… 17

2-9-6-3.سفالوسپورین ها…………………………………………………………………………………………………………………………….. 17

2-9-6-4. مونوباکتام ها………………………………………………………………………………………………………………………………… 18

2-9-7.دیگر درمان های ترکیبی……………………………………………………………………………………………………………………… 18

2-10.مکانیسم عمل آنتی بیوتیک های بتالاکتام…………………………………………………………………………………………….. 18

2-10-1.پنی سیلین ها……………………………………………………………………………………………………………………………………. 18

2-10-2.کارباپنم ها……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 19

2-10-3.سفالوسپورین ها……………………………………………………………………………………………………………………………….. 19

2-11.مکانیسم های مقاومت……………………………………………………………………………………………………………………………. 20

2-11-1.مکانیسم های مقاومت آنتی بیوتیکی………………………………………………………………………………………………… 20

2-11-2.مکانیسم های مقاومت به بتالاکتام ها………………………………………………………………………………………………. 21

2-11-2-1. مکانیسم های آنزیمی…………………………………………………………………………………………………………………. 21

2-11-2-2.مکانیسم های غیر آنزیمی……………………………………………………………………………………………………………. 21

2-12.طبقه بندی بتالاکتامازها…………………………………………………………………………………………………………………………. 22

2-13.بتالاکتامازهای باکتری های گرم منفی…………………………………………………………………………………………………… 24

2-14.بتالاکتامازهای باکتری های گرم مثبت………………………………………………………………………………………………….. 24

2-15.بتالاکتامازهای وسیع الطیف………………………………………………………………………………………………………………….. 24

2-16.خصوصیات آنتی بیوتیک های وسیع الطیف…………………………………………………………………………………………. 25

2-17.حساسیت ESBL ها در مقابل آنتی بیوتیک ها……………………………………………………………………………………. 25

2-18.انواعESBL  ها…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 26

2-18-1.بتالاکتامازهای تیپ SHV……………………………………………………………………………………………………………….. 26

2-18-2.بتالاکتامازهای تیپ TEM………………………………………………………………………………………………………………. 26

2-18-3.بتالاکتامازهای تیپ OXA………………………………………………………………………………………………………………. 27

2–18-4.بتالاکتامازهای تیپCTX-M……………………………………………………………………………………………………….. 27

2-18-5. بتالاکتامازهای تیپ NDM(متالوبتالاکتاماز)…………………………………………………………………………………. 27

2-18-6.بتالاکتامازهای تیپ VIM(متالوبتالاکتاماز)……………………………………………………………………………………. 28

2-19. فاکتور هایی که بر بیان بتالاکتامازها اثر می گذارند…………………………………………………………………………… 28

2-20.درمان عفونت های ایجاد شده توسط سویه های مولد ESBL…………………………………………………………… 29

2-21.کنترل……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 30

2-22.مثال هایی از مکانیسم های مقاومت به بتالاکتام ها……………………………………………………………………………… 30

2-22-1.مکانیسم مقاومت به کارباپنم ها………………………………………………………………………………………………………. 30

2-22-2.مکانیسم مقاومت به پنی سیلین ها…………………………………………………………………………………………………… 31

2-22-3.مکانیسم مقاومت به مونوباکتام ها……………………………………………………………………………………………………. 32

2-22-4.مقاومت به آمینوگلیکوزیدها…………………………………………………………………………………………………………….. 32

2-22-5. مقاومت به پلی میکسین ها…………………………………………………………………………………………………………….. 33

2-22-6.مقاومت به کینولون ها………………………………………………………………………………………………………………………. 33

2-22-7.مقاومت به تتراسایکلین ها و تایگلسین ها……………………………………………………………………………………… 33

2-23.مهارکنندگان بتالاکتامازها……………………………………………………………………………………………………………………… 34

2-23-1.مکانیسم عمل مهارکنندگان بتالاکتامازها…………………………………………………………………………………………. 34

2-24.روش های شناسایی آنزیم های ESBL………………………………………………………………………………………………. 35

2-24-1-1.آزمایش مجاورت دو دیسک……………………………………………………………………………………………………….. 35

2-24-1-2.ترکیب دو دیسک…………………………………………………………………………………………………………………………. 36

2-24-1-3.آزمایش سه بعدی………………………………………………………………………………………………………………………… 36

2-25.شیوع بیمارستانی و ارزیابی میزان کنترل………………………………………………………………………………………………. 36

2-26.اپیدمیولوژی جهانی اسینتوباکتر بومانی…………………………………………………………………………………………………. 37

2-27. روش مولکولی دخیل در بررسی باکتری های مولد آنزیم های بتالاکتاماز وسیع الطیف………………….. 38

2-27-1. واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR)…………………………………………………………………………………………….. 39

2-28.سوابق و پیشینه تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………….. 41

 

 

 

 

 

 

فصل سوم – مواد و روش‏ها

3-1-وسایل موردنیاز……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 37

3-2-مواد موردنیاز…………………………………………………………………………………………………………………………………………… 38

3-3-طریقه ساخت محیط های کشت…………………………………………………………………………………………………………….. 40

3-3-1.طرز تهیه محیط بلاد آگار(محیط پایه شرکت Merck )…………………………………………………………………. 40

3-3-2. طرز تهیه محیط نوترینت آگار (شرکت Merck)…………………………………………………………………………… 40

3-3-3. طرز تهیه محیط SIM(شرکت Merck )………………………………………………………………………………………. 41

3-3-4. طرز تهیه محیط مک کانکی آگار(شرکت Merck )……………………………………………………………………… 41

3-3-5. طرز تهیه محیط اوره براث(شرکت Merck )………………………………………………………………………………… 42

3-3-6. طرز تهیه محیط مولر هینتون آگار(شرکت Merck ):……………………………………………………………… 42

3-3-7. طرز تهیه محیط MRVP(شرکت Merck )……………………………………………………………………………. 52

3-3-8. طرز تهیه محیط BHI براث(شرکت Merck)……………………………………………………………………………….. 52

3-3-9. طرز تهیه محیط TSI(شرکت Merck ):……………………………………………………………………………………….. 53

3-3-10. طرز تهیه محیط سیمون سیترات (شرکت Merck )……………………………………………………………………. 54

3-3-11. طرز تهیه محیط OF(شرکت Merck ):………………………………………………………………………………       54

3-4. روش انجام این پژوهش…………………………………………………………………………………………………………………………. 55

3-4-1.جمع آوری نمونه………………………………………………………………………………………………………………………………… 55

3-4-2.جداسازی باکتری ها…………………………………………………………………………………………………………………………… 55

3-4-3. نگه داری باکتری ها در 80- درجه سلسیوس…………………………………………………………………………………. 57

3-5.آنتی بیوگرام……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 57

3-5-1-تهیه سوسپانسیون باکتریایی………………………………………………………………………………………………………. 57

3-5-2-روش آنتی بیوگرام…………………………………………………………………………………………………………………………….. 58

3-6.استخراج ژنوم به روش جوشاندن…………………………………………………………………………………………………………… 59

3-7. اندازه گیری غلظت DNA ژنومیک تخلیص شده…………………………………………………………………………………. 59

3-8. الکتروفورز محصول استخراج ژنوم……………………………………………………………………………………………………….. 59

3-9.مواد و وسایل مورد نیاز برای اجرای PCR……………………………………………………………………………………………. 59

3-9-1.DNA الگو…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 59

3-9-2.Master Mix………………………………………………………………………………………………………………………………….. 60

3-9-3.پرایمر…………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 60

3-9-4.محلول کار پرایمر PCR……………………………………………………………………………………………………………………. 61

3-10.روش اجرا PCR………………………………………………………………………………………………………………………………….. 61

3-11.مواد و وسایل مورد نیاز برای اجرای الکتروفورز………………………………………………………………………………….. 63

3-11-1.بافرTBE 5X…………………………………………………………………………………………………………………………………… 63

3-11-2.بافر TBE 1X…………………………………………………………………………………………………………………………………. 63

3-11-3.ژل آگارز 5/1 درصد………………………………………………………………………………………………………………………. 63

3-12.روش انجام الکتروفورز…………………………………………………………………………………………………………………………. 64

3-13.تعیین توالی……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 64

فصل چهارم – نتایج و بحث

4-1.جداسازی، کشت، تشخیص نمونه های باکتری……………………………………………………………………………………….. 65

4-1-1. درصدو تعداد گونه های مختلف موجود در نمونه های جدا شده از بیماران………………………………….. 65

4-1-2. نتایج تست های افتراقی برای گونه های اسینتوباکتر بومانی…………………………………………………………….. 67

4-1-3. تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن…………………………………………………………………… 67

4-1-3-1.نتایج حاصل از روش دیسک دیفیوژن برای تمام ایزوله های اسینتوباکتر بومانی………………………… 67

4-1-3-2. تهیه الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی………………………………………………………………………………………………… 69

4-2.استخراج DNA……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 72

4-3.نتایج بدست آمده در بررسی ژن کد کننده آنزیمblaVIM………………………………………………………………….. 73

4-4.نتایج بدست آمده در بررسی ژن کدکننده آنزیم blaNDM………………………………………………………………… 74

4-5:.بحث………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 76

 

فصل پنجم – نتیجه‏گیری

5-1- نتیجه‏گیری……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 80

5-2-پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 82

منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 83

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 94

 

فهرست جدول‏ها

عنوان                                                                                                                        صفحه

جدول2-1:طبقه بندی بتالاکتامازها در باکتری های گرم منفی……………………………………………………………………….. 23

جدول شماره 3-1: ترکیبات پایه ی محیط بلاد آگار……………………………………………………………………………………… 49

جدول شماره 3-2: ترکیبات محیط نوترینت آگار………………………………………………………………………………………….. 49

جدول شماره 3-3: ترکیبات محیط SIM……………………………………………………………………………………………………….. 50

جدول شماره 3-4: ترکیبات محیط مک کانکی آگار…………………………………………………………………………………….. 50

جدول شماره 3-5: ترکیبات محیط اوره براث……………………………………………………………………………………………….. 51

جدول شماره 3-6: ترکیبات محیط مولر هینتون آگار……………………………………………………………………………………. 51

جدول شماره 3-7: ترکیبات محیط MRVP………………………………………………………………………………………………….. 52

جدول شماره 3-8: ترکیبات محیط BHI براث………………………………………………………………………………………………. 52

جدول جدول شماره 3-9: ترکیبات محیط TSI……………………………………………………………………………………………… 53

جدول جدول شماره 3-10: ترکیبات محیط سیمون سیترات………………………………………………………………………… 54

جدول شماره 3-11: ترکیبات محیط OF………………………………………………………………………………………………………. 55

جدول شماره 3-12:خلاصه نتایج حاصل از محیطOF………………………………………………………………………………….. 56

جدول شماره3-13:توالی پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه…………………………………………………………………. 60

جدول شماره 3-14: محلول کاری پرایمر……………………………………………………………………………………………………… 61

جدول شماره3-15: ترکیب واکنش PCR برای هر نمونه………………………………………………………………………………. 62

جدول شماره3-16: برنامه انجام واکنش PCR برای ژن VIM……………………………………………………………………… 62

جدول شماره 3-17 برنامه انجام واکنش PCR برای ژن NDM……………………………………………………………………. 62

جدول شماره3-18: طرز تهیه بافر TBE 5X…………………………………………………………………………………………………… 63

جدول شماره 4-1 : فراوانی اسینتوباکتر بومانی در نمونه کلینیکی مورد بررسی………………………………………….. 66

جدول شماره 4-2: خصوصیات بیو شیمیایی اسینتوباکتر بومانی…………………………………………………………………… 67

جدول شماره 4-3: نتایج حساسیت اسینتوباکتر بومانی به دیسک های آنتی بیوتیکی در نمونه های کلینیکی مورد بررسی   68

جدول شماره 4-4 : الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی در اسینتوباکتر بومانی……………………………………………………… 70

 

 

فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                                        صفحه

نمودار شماره 4-1: فراوانی سویه های اسینتوباکتر در نمونه های کلینیکی مورد بررسی…………………………….. 66

نمودار شماره 4-2 : درصد مقاومت مشاهده شده در بین ایزوله های جدا شده از بیماران…………………………. 69

نمودار شماره4-3: درصد فراوانی ژن های VIM,NDMمورد مطالعه در اسینتوباکتر بومانی های ایزوله شده از بیماران     7

فهرست شکل‏ها

عنوان                                                                                                                        صفحه

شکل 4-1: بررسی کیفی .الکتروفورز نمونه‌هاي DNA  استخراج شده با روش جوشاندن بر روي ژل آگارز 1….. 72

شکل 4-2: بررسی کمی. نتایج اندازه گیری غلظت DNA استخراجی با روش جوشاندن با دستگاه نانودراپ در طول موج 260 نانومتر………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 72

شکل شماره 4-3: الکتروفورز ژل آگارز محصول آمپلی فایل شده ی ژن bla_VIM در سویه های اسینتوباکتر بومانی با PCR           73

شکل شماره 4-4 :الکتروفورز ژل آگارز محصول آمپلی فای شده ی ژن bla_NDM در سویه های اسینتوباکتر بومانی با PCR