بررسی تنوع نوکلئوتیدی ویروس موزائیک هندوانه در استرین های استان گلستان

فهرست مطالب

فصل اول. 2

1- مشخصات میزبان (هندوانه) 3

1-1- تاریخچه ی هندوانه 3

1-2- گیاهشناسی هندوانه 3

1-3- نیاز آب و هوایی هندوانه 4

1-4- نیاز خاک و کود در هندوانه 5

1-2- بیماریهای ویروسی هندوانه 5

1-2-1- علایم بیماریهای ویروسی هندوانه 6

1-3- فرضیه ها 6

1-4- اهداف.. 6

فصل دوم 7

2-1- ویژگیهای گروه پوتی ویروس‏ها 9

2-2- ویروس موزاییک هندوانه 9

2-3- ویروس موزاییک هندوانه در ایران. 10

2-4- ویروس موزاییک هندوانه در خارج از کشور 12

فصل سوم 14

3-1- نمونه برداری از مزارع جالیز استان گلستان. 15

3-2- مواد گیاهی. 15

3-2-1- نگهداری نمونه ها در آزمایشگاه 16

3-3-آزمون ساندویچ دوطرفه الایزا (DAS-ELISA) 16

3-3-1-مرحله اول پوشش دادن چاهک های بشقابک با IgG-WMV.. 16

3-3-2-مرحله دوم ریختن آنتیژن (عصارهها) در چاهک ها 17

3-3-3-مرحله سوم ریختن آنتی بادی متصل شده به آنزیم (IgG-conj.) 17

3-3-4-مرحله چهارم ریختن سوبسترا 17

3-4- ارزیابی نتایج آزمون الایزا 18

3-5- انتخاب جدایه های مثبت.. 18

3-6- مطالعات گلخانه ای. 19

3-6-1- آماده سازی گیاهان محک.. 19

3-6-2- مایه زنی گیاهان محک.. 19

3-7- استخراج RNA کل گیاهی. 21

3-8- بررسی کمیت و کیفیت RNA کل استخراج شده 22

3-8-1- روش الکتروفورز ژل آگارز: 22

3-9- ساخت cDNA.. 23

3-10- انجام واکنش PCR.. 24

3-10-1- طراحی پرایمر. 24

3-10-2- بررسی محصول RT-PCR.. 26

3-11- روش مقايسه توالي نوکلئوتيدي نژاد WMV استان گلستان با توالي های مشابه در ساير جدايه هاي موجود در بانک ژن. 26

فصل چهارم 28

4-1- نتایج نمونه برداری. 29

4-2- نتایج آزمون DAS-ELISA.. 30

4-3 نتایج مطالعات گلخانهای. 31

4-3-1- بررسی علائم ویروس موزائیک هندوانه روی گیاهان محک.. 31

4-4- نتایج استخراج RNA کل گیاهی. 32

4-5- نتایج آزمون RT-PCR.. 32

4-6- تنوع ژنتیکی. 33

3- تغییرات نوکلئیوتیدی بین جدایه های WMV. 36

فصل پنجم. 40

پیشنهادات اجرایی و مدیریتی. 43

منابع. 45

منابع انگلیسی. 48

فهرست  جداول

جدول 3-1- مواد لازم و مقدار هریک از آنها برای تهیه cDNA………………………………………………………………….24

جدول 3-2- توالي آغازگر­هاي مورد استفاده در اين تحقيق………………………………………………………………24

جدول 3-3- مواد لازم و مقدار هر یک از آنها برای تهیه محلول پایه PCR……………………………………….25

جدول 4-1- فراوانی ویروس موزائیک هندوانه در کل نمونه­ها به تفکیک منطقه نمونه­برداری……………….30

جدول 4-2- تنوع ژنتیکی و نسبت جانشینی آمینواسیدی در جدایه های مختلف WMV در جمعیت‌ها و گروه‌های فیلوژنتیک………………………………………………………………………………………………………..37

 

 

فهرست اشکال

شکل 3-1- مراحل کاشت گیاهان محک (سمت راست، مرحله 6-4 برگی و سمت چپ، آماده سازی بستر­های کاشت)……………………………………………………………………………………………………………………………….20

شکل4-1- گیاه  هندوانه آلوده به ویروس موزائیک هندوانه، علائم موزائیک پهنک برگ (سمت چپ)، بدشکلی و تاولی شدن میوه (سمت راست)…………………………………………………………………………………….29

شکل 4-2- علائم آلودگی به ویروس موزائیک هندوانه، در گیاه خربزه (.A کاهش رشد B. نخی شدن برگ کدو)…………………………………………………………………………………………………………………………………..30

شکل 4-3- ایجاد لکه­های موضعی بر روی گیاه محک سلمه تره بر اثر تلقیح ویروس WMV…………….31

شکل 4-4. نتایج آزمون PCR در ژل آگارز 1% با بافر TBE. سمت چپ: مارکر DNA.چاهک 1، کنترل منفی با آب مقطر وچاهک های 2 تا 7، آلوده به WMV. ( به ترتیب در هندوانه، خربزه و خیاره از هر گیاه دو نمونه) قطعه ای به اندازه 1055 نوکلئوتید تکثیر شده است…………………………………….32

شکل4-5- درخت فیلوژنتیک ترسیم شده به روش ماکسیمم پارسیمونی, بدست آمده از همردیف سازی ترادف نوکلئوتیدی ناحیه   -CPژن پروتئین پوششی جدایه WMV  گلستان با دیگر جدایه­های WMV از سایر نقاط دنیا………………………………………………………………………………………………………………………….34

شکل4-6 درخت فیلوژنتیکی ترسیم شده به روش neighbour joining، بدست آمده از همردیف سازی 750 نوکلئوتید از ژن پروتئین پوششی 31 جدایه WMV. مقدار bootstrap، 100 برای محاسبه روابط فیلوژنتیکی به کار رفته است………………………………………………………………………………………………………….35

شکل 4-7- درصد شباهت و تفاوت جدايه­ WMV گلستان با سایر جدایه­های این ویروس در دنیا براساس هم رديف­­سازی ترادف­های نوکلئوتیدی ژن CP  توسط نرم‌افزار DNASTAR (MegAlign)…………………………………………………………………………………………………………………38

شکل 4-8- درصد شباهت و تفاوت جدايه­ WMV گلستان با سایر جدایه­های این ویروس در دنیا  براساس هم رديف­­سازی ترادف­های آمینواسیدی ژن CP  توسط نرم‌افزار DNASTAR (MegAlign)………………………………………………………………………………………………………