بررسی بیان ژن های CYP27A1،CYP27B1،IL2،IL4،IL6،IL17A در افراد مبتلا به مولتیپل اسکلروزیس قبل و بعد از تیمار با ویتامین D

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                           صفحه

فصل اول :مقدمه و مروری بر مطالب

گذشته………………………………… 1

1-1مولتیپل اسکلروزیس…………………… 2

1 -1-1 نشانه ها و علائم بالینی مولتیپل اسکلروزیس 3

1-2 انواع بیماری مولتیپل اسکروزیس……….. 4

1-2-1 عودکننده-بهبودپذیر ………………. 4

1-2-2 پیشرونده ثانویه………………….. 4

1-2-3 پیشرونده اولیه…………………… 4

1-2-4 پیشرونده عودکننده………………… 5

1-3 اپیدمیولوژی……………………….. 5

1-3-1 مهاجرت………………………….. 6

1-3-2 سن……………………………… 7

1-4 نقش ژنتیک در بیماری MS …………….. 7

1-4-1 مطالعات خانوادگی…………………. 7

1-4-2. آلل های HLA  و MS………………… 8

1-4-3 ژن های غیر هاپلوتیپ HLA ………….. 8

1-4-4 نژاد …………………………… 9

1-5 فاکتورهای محیطی …………………… 9

1-5-1 ویروس اپیشتن بار ………………… 9

1-5-2 ویتامین D ………………………. 10

1-6 تشخیص MS …………………………. 10

1-7 درمان MS………………………….. 11

1-8 بیان مسئله………………………… 12

1-8-1 پاتوژنز بیماری مولتیپل اسکروزیس……. 12

1-8-2 میلین سازی مجدد و ترمیم  …………. 17

1-8-3 نقش سیستم ایمنی در مولتیپل اسکلروزیس.. 18

1-8-3-1 نقش سلول های Th1,Th2, در MS ………. 20

1-8-3-2 نقش سلول های B در MS …………… 21

1-8-4 نقش ویتامین D در مولتیپل اسکلروزیس…. 22

1-8-4-1 بیوشیمی ویتامین D. …………….. 22

1-8-4-2 سیگنالینگ  ……………………. 24

1-8-4-3 ویتامین D و سیستم ایمنی ………… 27

1-8-4-4 بیماری های خود ایمنی وویتامین D …. 30

1-8-4-5 مولتیپل اسکلروزیس و ویتامین D …… 30

1-8  سیتوکین ها……………………….. 31

1-8-1 اینترلوکین -2 …………………… 33

1-8-2  اینترلوکین-4 …………………… 34

1-8-3 اینترلوکین-6 ……………………. 36

1-8-4 اینترلوکین-17A …………………… 37

1-8-5 CYP27A1 …………………………. 39

1-8-6 CYP27B1   ………………………… 39

1-9  سوالات پژوهش  …………………….. 41

1-10 اهداف …………………………… 42

فصل دوم : مواد،روش ها و بیماران………. 43

2-1 بیماران ………………………….. 44

2-2 مواد …………………………….. 44

2-2-1 بافرها و محلول ها………………… 44

2-2-1-1 ساخت محلول EDTA ……………….. 44

2-2-1-2 ساخت محلول Tris-HCL ………………. 45

2-2-1-3 بافرهاو محلول های مورد نیاز برای الکتروفورز ژل آگارز  45

2-2-1-3-1 تهیه بافر الکتروفورز TAE………. 45

2-2-1-3-2 ساخت محلول اتیدیوم بروماید ……. 46

2-2-1-4 بافرها و محلول های مورد نیاز الکتذوفورز ژل آکریلامید   46

2-2-1-4-1 محلول اصلی 30% آکریلامید ………. 46

2-2-1-4-2 روش تهیه محلول استوک APS ……… 47

2-2-1-4-3 محلول X5 TBE …………………. 47

2-2-1-4-4 محلول X1 TBE ………………… 47

2-2-1-4-5 محلول TEMED …………………. 47

2-2-1-4-6 پرسولفات آمونیوم …………….. 48

2-2-1-5 محلول های مورد نیاز برای استخراج RNA از بافت خون .    48

2-2-1-5-1 کیت ها ……………………… 49

2-2-1-5-2 ووسایل ……………………… 49

2-3 روش ها …………………………… 50

2-3- استخراج RNA  از خون تام ……………. 50

2-3-1-1 جداسازی  سلول های تک هسته ای خون کحیطی از نمونه های خون .  50

2-3-1-2  آ ماده سازی نمونه سلولی هوموژن …. 50

2-3-1-3 استخراج RNA  از سلول های تک هسته ای خون محیطی     51

2-3-1-3-1 مواد و وسایل مورد نیاز ……….. 51

2-3-1-4 اسپکتروفتومتری ………………… 53

2-3-1-5 الکتروفورز ……………………. 53

2-3-2 تیمار RNA با DNase I ………………. 54

2-3-3 واکنش رونویسی معکوس………………. 55

2-3-5-1 بررسی کیفیت c DNA ساخته شده با PCR .. 57

2-3-5-2 مشاهده محصولات PCR روی ژل آگارز ….. 57

2-4 تعیین کارایی Real time-PCR با رسم منحنی استاندارد   57

2-4-1 واکنش Real time PCR …………………. 58

2-4-2 آنالیز داده ها ………………….. 58

2-4-2-1 روش DD Ct   ……………………. 59

2-4-3 طراحی پرایمرها ………………….. 59

2-4-4 توالی و مشخصات پرایمرهای مخصوص ……. 60

2-4-5 انجام ئواکنش Real time PCR …………… 62

2-4-6 تایید نهایی محصولات Real time PCR ……… 63

2-4-7 هضم آنزیمی ……………………… 63

2-4-7-1 مقادیر مورد نیاز برای هضم آنزیمی … 63

2-4-7-2 الکتروفورز ژل پلی اکریلامید ……… 63

2-4-7-2-1 روش تهیه مواد وبافرها ………… 64

2-5 آنالیز آماری ……………………… 65

فصل3: نتایج …………………………. 66

3-1 نمونه گیری و اطلاعات دموگرافیک بیماران… 67

3-2 تعیین سطح ویتامین D پس از درمان با مکمل ویتامین D    67

3-3 بررسی شدت ناتوانی بالینی EDSS Scores)) دربیماران تحت درمان ویتامین D …………………………………….. 69

3-4 آنالیزمیزان بیان ژن ها قبل و بعد از تیمار با ویتامین D .  70

3-4-1 استخراج RNA و تعیین کیفی و کمی آن …. 70

3-4-2 ساخت c DNA و RT-PCR ………………. 71

3-4-3 تایید محصولات تکثیر شده …………… 71

3-5 بررسی اختصاصیات تکثیر پرایمرهای طراحی شده   73

3-6  نتایج آنالیزبیان ژن ها توسط Real time PCR.. 77

3-6-1 بررسی بیان ژن  IL2قبل وبعد از تیمار با ویتامین D     77

3-6-2 بررسی بیان ژن IL4  قبل وبعد از تیمار با ویتامین D .  80

3-6-3  بررسی بیان ژن IL6  قبل وبعد از تیمار با ویتامین D  82

3-6-4 بررسی بیان ژن IL17A قبل وبعد از تیمار با ویتامین D. 84

3-6-5 بررسی بیان ژن CYP27A1  قبل و بعد از تیمار با ویتامین D   87

3-6-6 بررسی بیان ژن CYP27B1  قبل و بعد از تیمار با ویتامین D   89

3-7 بررسی ارتباط بین بیان ژن های مورد مطالعه .  92

3-8 بررسی ارتباط بین میزان بیان ژن های مورد مطالعه با ویژگی های بالینی بیماران RRMS

 ……………………………………. 93

فصل چهارم : بحث و پیشنهادها ………….. 94

4-1 اهمیت مطالعه ویتامین D در پژوهش …….. 95

4-2 نقش ویتامین D در بیماری مولتیپل اسکلروزیس 97

4-2-1 تغییرات بیان ژن های CYP27A1    و  CYP27B1  پس از ویتامین D درمانی در

بیماران مبتلا به MS …………………….. .97

4-2-2 تغییرات بیان ژن های IL2   و  IL4  پس از ویتامین D درمانی در بیماران مبتلا

به MS ……………………………….. .100

4-2-3 تغییرات بیان ژن های IL6   و  IL17A  پس از ویتامین D درمانی در بیماران مبتلا

به MS………………………………… .103

4-3 اثر جنسیت روی بیان ژن های مورد مطالعه .. 106

4-4 تغییرات سطح بسرمی ویتامین D…………. .106

منابع ……………………………….. 110

فهرست جداول

عنوان                                                                                                  صفحه

جدول  2-……………………………… 61

جدول 2-2 …………………………….. 62

جدول 3-1 …………………………….. 92

جدول 3-2 …………………………….. 93

 

فهرست اشکال

عنوان                                                                                          صفحه

شکل 1-1 انواع مختلف بیماری MS. …………. ..5

شکل1-2 توزیع جغرافیایی MS ……………… ..6

شکل 1-3 سلول عصبی فرد طبیعی و مولتیپل اسکلروزیس      13

شکل1-4 ساختمان میلین ………………….. 14

شکل 1-5 مسیر های اصلی متابولیسم ویتامین D… 26

شکل 1-6 مکانیسم های پاسخ ایمنی ذاتی و سازگار به ویتامین D     .29

شکل 1-7 عرضه آنتی ژن به سلول های دندیتی و T دست نخورده    32

شکل 1-8 نقش عوامل التهابی در بروز MS…….. .41

تصویر 3-1 سطح سرمی 25(OH)D بیماران قبل و بعد از درمان با ویتامین D……………………….67

تصویر 3-2 تغییرات ویتامین D در هریک از بیماران 68

تصویر 3-3 میانگین EDSS Scores قبل و بعد از ویتامین Dدرمانی به مدت هشت هفته……69

تصویر 3-4 ارتباط  EDSS Scores با مدت بیماری و سن پیش از تیمار با ویتامین D…………70

تصویر 3-5 ژل الکتروفورز RNA و ساخت c DNA … 71

تصویر  3-6 بررسی الگوی برشی محصولات تکثیر شده جهت تایید قطعات مورد نظر ژن های  CYP27B1، IL4 ،CYP27A1 ، IL6  ، IL17A و IL2   72و73.

تصویر 3-7 نمودار دمای ذوب محصول تکثیر شده و محصول تکثیر c DNA ژن اختصاصی

   GAPDH .،.IL2 ،IL4  ،  IL6 ، IL17A ، CYP27A1 و  CYP27B1……………….74-77

تصویر 3-8 بررسی بیان ژن IL2 در بیماران مبتلا به MS قبل و بعد از تیمار به مدت هشت هفته با

ویتامینD……………………………… 78

تصویر 3-9 مقایسه میانگین بیان ژن IL2 قبل و بعد از مصرف ویتامین D در کل بیماران و

گروه های پاسخ ده و غیر پاسخ ده به ویتامین D  78

تصویر 3-10 مقایسه میانگین بیان ژن IL2 قبل و بعد از مصرف ویتامین D در گروه های EDSS≤2

 , EDSS>2 وزنان و مردان…………………… .79

تصویر 3-11 بررسی بیان ژن IL4 در بیماران مبتلا به MS قبل و بعد از تیمار به مدت هشت هفته

 با ویتامینD ………………………………………………………………………………………………………………………………..80

تصویر 3-12 مقایسه میانگین بیان ژن IL4 قبل و بعد از مصرف ویتامین D در کل بیماران و

گروه های پاسخ ده و غیر پاسخ ده به ویتامین D   .81

تصویر 3-13  مقایسه میانگین بیان ژن IL4 قبل و بعد از مصرف ویتامین D در گروه های EDSS≤2 ,

EDSS>2 وزنان و مردان……………………. 82

تصویر 3-14 بررسی بیان ژن IL6 در بیماران مبتلا به MS قبل و بعد از تیمار به مدت هشت

هفته با ویتامینD………………………. .83

تصویر 3-15 مقایسه میانگین بیان ژن IL6 قبل و بعد از مصرف ویتامین D در کل بیماران و

گروه های پاسخ ده و غیر پاسخ ده به ویتامین D . 83

تصویر 3-16 مقایسه میانگین بیان ژن IL6 قبل و بعد از مصرف ویتامین D در گروه های EDSS≤2 , EDSS>2 وزنان و مردان……… 84

تصویر 3-17 بررسی بیان ژن IL17A در بیماران مبتلا به MS قبل و بعد از تیمار به مدت

هشت هفته با ویتامینD  ………………….. 85

تصویر 3-18 مقایسه میانگین بیان ژن IL17A قبل و بعد از مصرف ویتامین D در کل بیماران

 و گروه های پاسخ ده و غیر پاسخ ده به ویتامین D  85

تصویر 3-19 مقایسه میانگین بیان ژن IL17A قبل و بعد از مصرف ویتامین D در گروه های

 EDSS≤2 , EDSS>2 وزنان و مردان…………….. 86

تصویر 3-20 بررسی بیان ژن CYP27A1 در بیماران مبتلا به MS قبل و بعد از تیمار به مدت

هشت هفته با ویتامینD…………………… 87

تصویر 3-21 مقایسه میانگین بیان ژن CYP27A1 قبل و بعد از مصرف ویتامین D در کل بیماران

 و گروه های پاسخ ده و غیر پاسخ ده به ویتامین D  88

تصویر 3-22 مقایسه میانگین بیان ژن CYP27A1 قبل و بعد از مصرف ویتامین D در گروه های EDSS≤2 , EDSS>2 وزنان و مردان ….. 89

تصویر 3-23 بررسی بیان ژن CYP27B1 در بیماران مبتلا به MS قبل و بعد از تیمار به مدت

هشت هفته با ویتامینD…………………… 90

تصویر 3-24 مقایسه میانگین بیان ژن CYP27B1 قبل و بعد از مصرف ویتامین D در کل بیماران

 و گروه های پاسخ ده و غیر پاسخ ده به ویتامین D  90

تصویر 3-25 مقایسه میانگین بیان ژن CYP27B1 قبل و بعد از مصرف ویتامین D در گروه های EDSS≤2 , EDSS>2 وزنان و مردان…… 91