بررسی اثر خاموش کنندگی miR-330-5p بر بیان ژن و بروز پروتئین TIM-3 در رده‌های سلولی AML

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                                                                  صفحه

چکیده فارسی……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 1

فصل اول/ کلیات

1-1- مقدمه………………………………………………………………………………………………………………………………………… 3

1-2- بیان مسئله…………………………………………………………………………………………………………………………………. 4

1-3- مباحث نظری تحقیق…………………………………………………………………………………………………………………. 10

1-3-1- لوکمی میلوئید حاد یا AML……………………………………………………………………………………………….. 10

1-3-1-1- علائم بالینی AML………………………………………………………………………………………………………… 12

1-3-1-2- درمان AML………………………………………………………………………………………………………………….. 13

1-3-2- پروتئین (TIM-3)………………………………………………………………………………………………………………. 13

1-4- میکرو RNAها(miRNA ها)………………………………………………………………………………………………….. 17

1-4-1- بیوژنز میکرو RNAها و نحوه مهار ترجمه…………………………………………………………………………… 18

1-4-2- شناسایی مولکول­های هدف میکرو RNA…………………………………………………………………………….. 21

1-4-3- میکرو RNA و سرطان ……………………………………………………………………………………………………….. 22

1-5- اهداف تحقیق……………………………………………………………………………………………………………………………. 25

1-5-1- هدف كلي…………………………………………………………………………………………………………………………….. 25

1-5-2- اهداف جزيي(اختصاصي)…………………………………………………………………………………………………….. 25

1-5-3- هدف فرعي………………………………………………………………………………………………………………………….. 25

1-6- فرضیات تحقیق…………………………………………………………………………………………………………………………. 25

1-6-1- فرضيه اصلي………………………………………………………………………………………………………………………… 25

1-6-2- فرضيه فرعي………………………………………………………………………………………………………………………… 26

1-7- مروری بر پژوهش‌های پیشین……………………………………………………………………………………………………. 26

فصل دوم/ مواد و روش ها

2-1- نوع مطالعه………………………………………………………………………………………………………………………………… 30

2-2- وسایل و مواد لازم…………………………………………………………………………………………………………………….. 30

2-3- نمونه و روش نمونه گیری و جامعه آماری…………………………………………………………………………………. 32

2-4- تکنیک‌ها و روش آزمایشگاهی…………………………………………………………………………………………………… 32

2-4-1- تحریک با PMA…………………………………………………………………………………………………………………. 33

2-4-2- روش انتقال   Label IT RNAi Delivery Control-FITCبه درون سلول با استفاده از محلول X-tremgene    33

2-4-3- روش انتقال miR-330-5p به درون سلول با استفاده از محلول X-tremegene ……………… 34

2-4-4- آنالیز ایمنوسیتوشیمی……………………………………………………………………………………………………………. 35

2-4-5- روش Methylthiazole tetrazolium (MTT) assay……………………………………………… 36

2-4-6- روش انجام فلوسایتومتری جهت تعیین میزان بروز TIM-3…………………………………………………. 36

2-4-7- استخراج RNA…………………………………………………………………………………………………………………… 37

2-4-8- سنتزcDNA………………………………………………………………………………………………………………………… 39

2-4-9- Real time-PCR…………………………………………………………………………………………………………….. 39

2-4-10- Real time-stages………………………………………………………………………………………………………. 40

2-5- آنالیز آماری……………………………………………………………………………………………………………………………….. 41

فصل سوم/ نتایج

3-1- آنالیزهای بیوانفورماتیکی……………………………………………………………………………………………………………. 43

3-2- بروز پروتئین TIM-3 برروی سلول‌های AML رده‌ی HL-60 بعد از افزودن PMA به محیط کشت و بررسی آن بعد از 72 ساعت به وسیله فلوسایتومتری……………………………………………………………………………………………………………… 43

3-2-1-تصویر دریافت شده از میکروسکوپ اینورت پس از تیمار سلول‌های AML رده HL-60 با PMA بعد از 72 ساعت    44

3-3- بررسی بازده ترانسفکشن بر رده‌ی سلولی HL-60 بعد از انتقال siRNA FITC به داخل سلول‌ها توسط فلوسایتومتری     45

3-4- بررسی بیان پروتئین TIM-3 بر روی رده‌ی سلولی HL-60 بدون تیمار با PMA…………………….. 46

3-4-1- تصویر گرفته شده توسط میکروسکوپ فلورسنت پس از ترانسفکت سلول­هایAML ردهHL-60 توسط LableIT siRNA Delivery Control-FITC …………………………………………………………………………………………………………… 47

3-5- بررسی بروز پروتئین TIM-3 بر روی سلول‌های رده‌ی HL-60 پس از ترانسفکت کردن با miR-330-5P mimic توسط فلوسایتومتری……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 48

3-6- نمایش باند پرایمر β-actin بر روی ژل آگاروز توسط روش RT-PCR…………………………………… 50

3-6- 1- نمایش نمودار Melt curve پرایمر β-actin در دستگاه Real Time-PCR…………………. 51

3-7- نمایش باند‌های پرایمرTIM-3  بر روی ژل آگاروز توسط روش RT-PCR……………………………… 52

3-7- 1- نمایش نمودار Melt curve پرایمرهای TIM-3  در دستگاه Real Time-PCR…………… 53

3-8- بررسی بیان ژن پروتئینTIM3  بر روی سلول‌های AML رده‌ی HL-60 بعد از ترانسفکت  با miR-330-5P mimic توسط q-PCR………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 54

3-9- بررسی توان زیستی سلول‌های AML رده‌ی HL-60 بعد از ترانسفکت با miR-330-5P mimic توسط روش MTT assey……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 55

فصل چهارم/ بحث و نتیجه گیری

4-1- بحث و نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………………………….. 57

4-2- نتیجه گیری کلی……………………………………………………………………………………………………………………….. 59

4-3- پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………. 59

منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 60

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 65

فهرست جداول

عنوان                                                                                                                                                                  صفحه

جدول 1-1: میکرو RNAها و هدف­های آن­ها در سرطان…………………………………………………………………….. 23

جدول 2-1: دستگاه های مورد استفاده…………………………………………………………………………………………………. 30

جدول 2-2: مواد مورد استفاده…………………………………………………………………………………………………………….. 31

جدول 2-3: وسایل مورد استفاده………………………………………………………………………………………………………….. 32

جدول 2-4: رده سلولی HL60…………………………………………………………………………………………………………… 32

جدول 2-5: توالی پرایمرهای اختصاصی β-Actin…………………………………………………………………………….. 40

جدول 2-6: توالی پرایمرهای اختصاصی TIM3…………………………………………………………………………………. 40