بررسي نسبت جمعيتي اسپرم‌هاي واجد كروموزم X‌و Y تحت تأثير برخي عوامل محيطي در گونه گاو با استفاده از تكنيك Real-Time PCR

فهرست مطالب

  عنوان                                                                                                                                 صفحه

چكيده فارسي    ……………………………………………………………………………………………              1 

مقدمه   ……………………………………………………………………………………………………….             2

 

فصل اول: كليات

پیشگفتار ………………………………………………………………………………………………………             4

• آناتومي دستگاه تناسلي دام نر …………………………………………………………………. 5

                                                                              

• اسپرماتيك كورد (بند بيضه) …………………………………………………………………… 6

1-1-2-  اسكروتوم(كيسه بيضه)………………………………………………………………………….            6

• ماهيچه دارتوس ……………………………………………………………………………… 7

• تونيكا واژنياليس …………………………………………………………………………….. 7

 

• بيضه‌ها …………………………………………………………………………………………… 8

 

• اپيديدیم …………………………………………………………………………………………    10

 

 

 

• غدد ضميمه تناسلي ………………………………………………………………………….. 12

  • آمپولا ………………………………………………………………………………………….. 12

1-1-5-2-  وزيكول سمينال ……………………………………………………………………………..           12 

1-1-5-3-  پروستات ………………………………………………………………………………………          13

1-1-5-4-  غدد كوپر ……………………………………………………………………………………..          13

 

• آلت تناسلي نر …………………………………………………………………………………. 14

 

• فيزيولوژي دستگاه تناسلي دام نر…………………………………………………………..          15

1-2-1-  اسپرماتوژنز ……………………………………………………………………………………….           15

1-2-1-1- اسپرماتوسيتوژنز ………………………………………………………………………………          15

1-2-1-2- اسپرميوژنز ……………………………………………………………………………………..          15

1-2-1-3- روند كلي اسپرماتوژنز ………………………………………………………………………..          16

 

1-2-2-  اسپرم ……………………………………………………………………………………………..          20

 

1-2-3- مايع مني …………………………………………………………………………………………..         21

 

• نسبت جنسي…………………………………………………………………………………… 21

1-3-1-  مقدمه ……………………………………………………………………………………………..         21 

• ژنتيك دام نر …………………………………………………………………………………… 22

 

• تفاوت اسپرم‌هاي واجد كروموزوم X و Y ……………………………………………….. 23

 

• تعريف نسبت جنسي …………………………………………………………………………. 25

 

• اهميت كنترل نسبت جنسي ……………………………………………………………….. 26

 

• عوامل موثر بر انحراف نسبت جنسي ……………………………………………………… 27 

1-3-6-1-  عوامل ژنتيكي و فيزيولوژيكي …………………………………………………………….        27

1-3-6-2– عوامل محيطي ………………………………………………………………………………..        28

 

• روش‌هاي تعيين نسبت جنسي اسپرم ……………………………………………………. 28 

 

• واکنش زنجیره­ای پلیمراز کیفی( PCR) ……………………………………     29

 

• واکنش زنجیره­ای پلیمرازکمّی((Real-Time PCR……………………….. 31

1-5-1-  تعریف واکنش (Real-Time PCR)  ……………………………………………………       31

1-5-2– مزایای واکنش Real-Time PCR ……………………………………………………….       31

• مراحل اصلی واکنش Real-Time PCR …………………………………………… 32

1-5-4- روش­های انجام واکنش Real-Time PCR ……………………………………………..       32

1-5-4-1- قالب غیر اختصاصی Nonspecific Format ……………………………………..       32

1-5-4-2- قالب اختصاصی Specific Format …………………………………………………..       34

1-5-4-2-1- شناساگرهای دوسویه نشاندار یا شناساگرهای TaqMan ……………………….       35

1-5-4-2-2- شناساگرهای بیکون مولکولی ……………………………………………………………       37

1-5-4-2-3- سیستم شناساگر FRET ………………………………………………………………       38

1-5-4-2-4- شناساگرهای عقربي ………………………………………………………………………       39

1-5-4-2-5- سایر سیستم­ها …………………………………………………………………………….       40

 

1-5-5- برخی مفاهیم و اصطلاحات در تکنیک Real-Time PCR ………………………….       41

1-5-5-1- منحنی تکثیر ………………………………………………………………………………….       41
1-5-5-2- گزارشگر نرمال­شده((Rn …………………………………………………………………..      43

1-5-5-3- چرخه آستانه( (CT …………………………………………………………………………      44

1-5-5-4- منحنی ذوب …………………………………………………………………………………..      45

1-5-5-5- منحنی استاندارد ……………………………………………………………………………..      47

 

1-5-6- آناليز داده‌هاي کمي …………………………………………………………………………….      49

 

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

• مطالعات پیرامون نسبت جنسی …………………………………………………………….. 51

• مطالعات روی روش­های تعیین نسبت جنسی ………………………………………………. 53  

فصل سوم: مواد و روش­ها

• زمان و محل انجام تحقیق………………………………………………………………… 58

• مراحل انجام کار…………………………………………………………………………….. 58

3-2-1- تهیه اسپرم…………………………………………………………………………………………        58

3-2-2- استخراج DNA از سلول­های اسپرم ………………………………………………………..        59

3-2-2-1- مواد و لوازم استخراج DNA ……………………………………………………………..        59 

3-2-2-2- روش کار برای استخراج DNA …………………………………………………………..        60

3-2-2-2-1- شستشوی اسپرم ………………………………………………………………………….        60

3-2-2-2-1-1- ساخت محلول PBS …………………………………………………………………        60

3-2-2-2-1-2- شستشو ………………………………………………………………………………….        61

3-2-2-2-2- پروتئین­زدایی ………………………………………………………………………………       62

3-2-2-2-2-1- ساخت محلول Lysis Buffer ……………………………………………………       62

3-2-2-2-2-2- رسوب پروتئین­ها ………………………………………………………………………       62  

3-2-2-2-3- جداسازی DNA …………………………………………………………………………       63 

3-2-2-2-4- تعیین غلظت DNA …………………………………………………………………….       64

3-2-2-2-4-1- استفاده از ژل آگارز …………………………………………………………………..       64 

3-2-2-2-4-1-1- مواد و لوازم ساخت ژل آگارز ……………………………………………………       64

3-2-2-2-4-1-2- روش کار با ژل آگارز ………………………………………………………………        65

3-2-2-2-4-2– استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومترِ نانودراپ ……………………………………        66

3-2-3- واکنش PCR کیفی …………………………………………………………………………….       66

3-2-3-1- هدف از واکنش PCR کیفی ………………………………………………………………       66

3-2-3-2- مواد و لوازم برای واکنش PCR کیفی ………………………………………………….       66

3-2-3-3- روش انجام واکنش PCR کیفی ………………………………………………………….       67

3-2-3-3-1-  طراحی آغازگر……………………………………………………………………………..       67     

3-2-3-3-2- رقیق­سازی آغازگرها……………………………………………………………………….       68

3-2-3-3-3- محاسبه مقادیر واکنشPCR کیفی……………………………………………………       69

3-2-3-3-4– تعیین شرایط واکنشPCR کیفی…………………………………………………….       70

3-2-3-3-5- آماده­سازی مخلوط واکنشPCR کیفی……………………………………………….       70

3-2-3-3-6- الکتروفورز محصولات PCR کیفی…………………………………………………….       71

3-2-4- واکنش Real-Time PCR………………………………………………………………….       71

3-2-4-1- – هدف از انجام واکنش Real-Time PCR………………………………………….       71

3-2-4-2- مواد و لوازم برای واکنش Real-Time PCR………………………………………..        71

3-2-4-3- روش انجام واکنش Real-Time PCR………………………………………………..        72

3-2-4-3-1- رقیق­سازی آغازگرها……………………………………………………………………….       72

3-2-4-3-2- محاسبه مقادیر در واکنش Real-Time PCR……………………………………       73  

3-2-4-3-3- تعیین شرایط دمایی و زمانی واکنش Real-Time PCR………………………       73

3-2-4-3-4- رسم منحنی استاندارد از طریق واکنش Real-Time PCR…………………..       74

3-2-4-3-5- بررسی CT و TM از طریق واکنش Real-Time PCR……………………..       74

3-2-4-3-6- آماده­سازی مخلوط واکنش Real-Time PCR…………………………………..       76

3-2-4-3-7- آنالیز داده­های واکنش Real-Time PCR………………………………………..       76 

 

فصل چهارم : نتایج

4-1- نتایج استخراج DNA ……………………………………………………………………………       78

4-1-1-   نتیجه الکتروفورز محصولات استخراجDNA……………………………………………       78

4-1-2- نتیجه غلظت­خوانی با دستگاه نانودراپ……………………………………………………..       79

4-2- نتیجه الکتروفورز محصولات PCR……………………………………………………………      80

4-3- نتایج حاصل از Real-Time PCR…………………………………………………………      82 

4-3-1- منحنی استاندارد…………………………………………………………………………………….        82     

4-3-2- منحنی ذوب و محاسبه TM……………………………………………………………………        83

4-3-3- منحنی تکثیر و محاسبه CT………………………………………………………………….          .87

4-3-4- نتیجه الکتروفورز محصولات Real-Time PCR………………………………………..      .90

4-3-5- آنالیز کمّی داده­ها…………………………………………………………………………………..       94    

 

فصل پنجم : بحث وپیشنهادات

5-1- بحث ……………………………………………………………………………………………….      .99     

5-2- پیشنهادات…………………………………………………………………………………….         102 

 

منابع   …………………………………………………………………………………………………………    103

چکیده انگلیسی  ………………………………………………………………………………………….    106    

ضمایم …………………………………………………………………………………………………………   108         

 

 

                                                                 فهرست جداول

  عنوان                                                                                                                               صفحه

جدول(3-1):شماره ثبت شده دام روی پایوت­های محتوی مایع منی………………………….……….    58

جدول(3-2): مواد تشکیل دهنده محلول PBS    ………………………………………………………… 60

جدول(3-3): مواد تشکیل دهنده محلول Lysis Buffer ………….…………………………………   62

جدول(3-4): اطلاعات مربوط به آغازگر­ها ………………………………………………………………..   68

جدول(3-5): مقادیر مواد واکنش PCR    ………………………………………………………………… 69

جدول(3-6): شرایط دمایی و زمانی واکنش PCR …………………………………………………….    70

جدول(3-7): مقادیر مواد واکنش PCR …………………………………………………………………    73

جدول(3-8): شرایط دمایی و زمانی واکنش PCR Real-Time   ……….…………………….……   74

جدول (4-1):غلظت DNA ( ng.µl^-1 ) برای 7 رأس گاو در فصل سرد…….…………………….…    79

جدول (4-2): غلظت DNA ( ng.µl^-1 ) برای 7 رأس گاو در فصل گرم…….…………….…………   79

جدول (4-3) : محاسبه میانگین عدد CT بین دو تکرار در هر نمونه……….…………….………..…   95

جدول (4-6) : عدد مقیاس مطلق(تفاوت عدد الگوی اولیه ژن SRY و PLP ….…………………    ………………97

 

 

فهرست اشکال

  عنوان                                                                                                                             صفحه

شکل (1-1) : اسپرماتیک کورد(بند بیضه)  ……………………………………………………………      6

شکل (1-2) : اسکروتوم (کیسه بیضه) …………………………………………………………………      7

شکل (1-3) : بیضه ها در گاو ………………………………………………………………………….       8

شکل (1-4) : بیضه ها ولوله های اسپرم ساز و شبکه رته تستیس …………………………………     10

شکل (1-5) : اپیدیدیم …………………………………………………………………………………     11

شکل (1-6) : غدد ضمیمه تناسلی     …………………………………………………………………… 13

شکل (1-7) : آلت تناسلی گاو  نر …………………………………….………………………………     14

شکل (1-8) : اسپرماتوژنز ………………………………………………………………………………     16

شکل (1-9) : اسپرماتوژنز و هورمون­ها ……………………………………………………………….     17

شکل (1-10) : مراحل سلولی اسپرماتوژنز ……………………………………………………………    19

شکل (1-11) : اسپرم ………………………………………………………………………………….    20

شکل (1-12) : کاریوتیپ گاو …………………………………………………………………………     22

شکل (1-13) : اسپرم واجد کروموزوم Y و X ………………………………………………………    24

شکل( 1-14) : مکانیسم عمل رنگ SYBR-Green طي واکنش زنجيره‌اي پليمراز(PCR)……33

شکل( 1-15) : مکانیسم عمل شناساگرهای دوسویه نشاندار یا شناساگرهای TaqMan  ………………..36

شکل( 1-16) : مکانیسم عمل شناساگرهای بیکون مولکولی طي واکنش زنجيره‌اي پليمراز(PCR)…….… 37

شکل( 1-17) : مکانیسم عمل شناساگر FRET طي واکنش زنجيره‌اي پليمراز(PCR) ………   38

شکل( 1-18) : مکانیسم عمل شناساگر عقربي طي واکنش زنجيره‌اي پليمراز(PCR)…..……… 40

شکل (1-19) : منحنی تکثیر در واکنش Real-Time PCR ………………………………..…  42

شکل (1-20) : رنگ مرجع خنثی) (ROX  ………………………………………………………   43

شکل (1-21) : منحنی تکثیر و نمایش CT ……………………………………………………….   44

شکل (1-22) : منحنی ذوب و Tm …………………………………………………………………  46

شکل (1-23) : منحنی استاندارد …………………………………………………………………….  48

شکل(3-1):پایوت­های محتوی مایع منی ……………………………………………………………  58

شکل (4-1) :  نتایج حاصل از استخراج DNA ……………………………………………………  78

شکل( 4-2 ): نتایج حاصل از PCR ………………………………………………………………..  81

شکل (4-3) : منحنی استاندارد ……………………………………………………………………..  82

شکل( 4-6 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای آغازگر SRY در فصل گرم ……..  84

شکل( 4-7 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای آغازگر SRY در فصل سرد  ……. 84

شکل( 4-8 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای آغازگر PLP در فصل گرم …….  85

شکل( 4-9 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای آغازگر PLP در فصل سرد …….  85

شکل( 4-10 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای آغازگر PARدر فصل گرم…….  86

شکل( 4-11 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای آغازگر PARدر فصل سرد…….  86

شکل( 4-12 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر SRY در فصل گرم ………….87

شکل( 4-13 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر SRY در فصل سرد…………  87

شکل( 4-14 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر PLP در فصل گرم …………   88

شکل( 4-15 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر PLP در فصل سرد …………  88

شکل( 4-16 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر PAR در فصل گرم…………  89

شکل( 4-17 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر PAR در فصل سرد .………  89

شکل( 4-18 ) : نتیجه واکنش qPCR  برای آغازگر SRY   ……………………………….... 91

شکل (4 – 19): نتیجه واکنش qPCR  برای آغازگر SRY ………………….………..……… 91

شکل(4-20) : نتیجه واکنش qPCR  برای آغازگر PLP  ………..…………………..………… 92

شکل(4-21) : نتیجه واکنش qPCR  برای آغازگر PLP    …………………………..…………92

شکل(4-22) : نتیجه واکنش qPCR  برای آغازگر  ..………………………..…………PAR   93

شکل(4-23) : : نتیجه واکنش qPCR  برای آغازگر .……………………..…………PAR…… 93

شکل (4-24) : فرمول­های محاسبه و آنالیز کمّی آزمایش  …………………………………..…   96