بررسي اتصال و تشکيل بيوفيلم باکتريايي بر روي سطوح و اثر عوامل ضد ميکروبي بر روي آن 

فهرست مطالب

عنوان……………………………………….. صفحه

فصل اول: مروري بر منابع……………………….. 1

1- مقدمه…………………………………….. 1

1-1- جوامع ميكروبي……………………………. 1

1-2- رفتارهاي جمعي……………………………. 2

1-3- ساختار و تمايز در بيوفيلم‌ها……………….. 2

1-4- فوائد اكولوژيكي؛ چرا يك بيوفيلم تشكيل مي‌شود؟… 3

1-4-1- حفاظت در برابر محيط اطراف……………….. 3

1-4-2- محافظت در برابر مواد ضد عفوني كننده………. 4

1-4-3- كسب مواد غذايي و همكاري‌هاي متابوليكي……… 4

1-4-3-1- كسب مواد غذايي……………………….. 4

1-4-3-2- همكاري‌هاي متابوليكي…………………… 5

1-4-4- كسب خصوصيات ژنتيك جديد………………….. 5

1-4-5- جنبه‌هاي ژنتيكي تشكيل بيوفيلم…………….. 6

1-5-فرايندهاي اوليه در تشكيل بيوفيلم و تمايز ساختاري حاصل از آنها  7

1-5-1- تمايز ساختاري………………………….. 7

1-5-2- تمايز فنوتيپي و اتصال اوليه……………… 8

1-5-3- اتصال برگشت‌ناپذير………………………. 8

1-6- بلوغ بيوفيلم…………………………….. 9

1- 7-كنده شدن به عنوان يك بخش از تكامل بيوفيلم…… 9

1- 8- تشكيل بيوفيلم به عنوان يك فرايند تكاملي……. 11

1-9- ارتباطات سلول-سلول در طول تشكيل بيوفيلم…….. 12

1- 10- خصوصيات بارز بيوفيلم……………………. 13

1-10-1- بيوفيلم به عنوان جوامع ميكروبي مرتبط از نظر فيزيولوژيكي    13

1-10-2- بيوفيلم به عنوان جوامع ميكروبي مرتبط از نظر رفتاري    13

1-10-3- بيوفيلم به عنوان جوامع ميكروبي با ساختار پيشرفته  13

1-11- فاكتورهاي شركت كننده در گسترش و بلوغ بيوفيلم.. 14

1-11-1- جنس سطح مواد………………………….. 15

1-11-2- مناسب بودن سطح مورد نظر………………… 15

1-11-3- صاف و صيقلي بودن سطح…………………… 15

1-11-4- شدت جريان آب………………………….. 15

1-11-5- محدوديت مواد غذايي…………………….. 16

1-12- بيوفيلم و انسان…………………………. 16

1-13- بيوفيلم در سيستم‌هاي آبي………………….. 18

1-14- فرايندهاي تميزسازي………………………. 20

1-15- ميكروارگانيسم‌هاي برج‌هاي خنك كننده…………. 21

1-15-1- جلبك‌ها……………………………….. 22

1-15-2- قارچ‌ها……………………………….. 23

1-15-3- باكتري‌ها……………………………… 24

1-16- چگونگي تغذيه‌باكتري‌ها در آب……………….. 25

1-17- مشكلات ايجاد شده در سيستم‌ برج‌هاي خنك كننده‌ توسط باكتري‌ها 25

1-18- خوردگي ميكروبي………………………….. 27

1-19- مسائل خوردگي……………………………. 27

1-20- مسائل ايجاد رسوبات………………………. 28

1-21- باكتري‌هاي توليد كننده‌ي لايه لعابي………….. 29

1-22- مراحل ايجاد تخريب زيستي در سيستم برج‌هاي خنك كننده   30

1-23- بيوسايدها………………………………. 30

1-23-1- خصوصيات اصلي يك بيوسايد………………… 31

1-23-2- بيوسايدهاي اكسيد كننده…………………. 31

1-23-2-1- كلرين………………………………. 32

1-23-2-2- بروماين و مشتقات آن………………….. 33

1-23-2-3- اوزون………………………………. 34

1-23-2-4- پراكسيد هيدروژن……………………… 34

1-23-3- بيوسايدهاي غير اكسيد كننده……………… 34

1-23-3-1- گلوتارآلدئيد………………………… 35

1-23-3-2- تركيبات آمونيوم چهار ظرفيتي…………… 35

1-23-3-3- ايزوتيازولون‌ها………………………. 36

1-24- مكانيسم‌هاي مقاومت باكتري‌ها در بيوفيلم به عوامل ضد ميكروبي    38

1-24-1- جلوگيري از انتشار به درون بيوفيلم……….. 38

1-24-2- مقاومت از طريق آنزيم…………………… 38

1-24-4- حالت متابوليك ارگانيسم‌ها در بيوفيلم……… 39

1-24-3- واكنش خنثي‌سازي عوامل ضد ميكروبي توسط بيوفيلم 39

1-24-5- سازش ژنتيكي…………………………… 40

فصل دوم: مواد و روش ها………………………… 41

2-1- مواد و وسايل…………………………….. 41

2-1-1- دستگاه‌ها و وسايل مورد استفاده……………. 41

2-1-2- مواد ضد ميكروبي يا بيوسايدها…………….. 42

2-1-3- مواد مورد استفاده………………………. 42

2- 1-4- محيط‌هاي كشت…………………………… 43

2-2- سويه‌هاي باكتري مورد استفاده……………….. 44

2-2-1- سويه‌هاي ايزوله شده‌ي مورد استفاده در اين تحقيق 44

2-2-2- مشخصات سويه‌ي استاندارد مورد استفاده در اين تحقيق   44

2- 3- مواد و روش‌هاي به كار رفته براي نمونه‌برداري…. 45

2-3- 1-روش‌هاي به كار رفته براي نمونه‌برداري………. 45

2-3-1-1- روش نمونه‌برداري از آب سيستم و لايه‌هاي بيوفيلم موجود در ديواره‌ي برج‌هاي خنك كننده……………………………… 45

2-3-1- 2- نمونه‌برداري از طريق گذاشتن كوپن‌هاي فلزي در معرض جريان آب سيستم خنك كننده……………………………………. 47

2-4- روش‌هاي به كار رفته براي جداسازي و شناسايي باكتري‌هاي تشكيل دهنده‌ي بيوفيل روي سطح كوپن و يا باكتري‌هاي موجود در آب نمونه‌برداري شده 48

2-4- 1- روش به كار رفته براي كشت و جداسازي باكتري‌ها. 48

2-4-1-1- روش جداسازي و كشت باكتري‌ها از نمونه‌ي كوپن.. 48

2-4-1-2- روش جداسازي و كشت باكتري‌ها از نمونه‌ي آب سيستم    48

2-4-2- شناسايي باكتري‌هاي جداسازي شده……………. 49

2-4-2-1- روش به كار رفته براي شناسايي باكتري‌ها…… 49

2-4-2-2- باكتري‌ استاندارد……………………… 49

2-4-2-3-  نمودار هاي شناسايي باكتري‌ها…………… 49

2-4-2-3-1- شناسايي اوليه‌ي باكتري‌هاي جنس باسيلوس….. 50

2-4-2-3-2- شناسايي مربوط به باكتري ميكروكوكوس لوتئوس 51

2-4-2-3-3- شناسايي اوليه‌ي باكتري‌هاي جنس آسينتوباكتر و برانهاملا 52

2-4-2-3-4- شناسايي اوليه‌ي باكتري‌ اکتينوباسيلوس…… 53

2-5- روش‌هاي به كار رفته براي سنجش هيدروفوبيسيتي سطح سلول‌هاي پلانكتونيك……………………………………………. 54

2-5-1- روش به كار رفته براي تعيين هيدروفوبيسيتي سطح سلول‌هاي پلانكتونيك……………………………………………. 54

2- 5-1-1- روش MATH براي سنجش هيدروفوبيسيتي سطح سلول‌ها     54

2-6- روش‌ به كار رفته براي سنجش هم اتصالي بين سويهء Micrococcus  با ساير باكتري‌هاي جدا شده از بيوفيلم…………………… 56

2-6-1- روش آزمايش co-adhesion MATH براي تعيين هم اتصالي   57

2-7- روش‌ به كار رفته براي سنجش هيدروفوبيسيتي سطح سلول‌هاي موجود در بيوفيلم……………………………………………. 58

2-7-1- روش MATH براي سلول‌هاي موجود در بيوفيلم……. 58

2-7- 1-1- روش تست لوله‌اي براي سلول‌هاي موجود در بيوفيلم    58

2-7-1-2- روش انجام آزمايش MATH براي سلول‌هاي موجود در بيوفيلم  59

2- 8- روش‌هاي به كار رفته در ارزيابي قدرت اتصال هر يك از باكتري‌ها به سطوح و بررسي ساختار بيوفيلم………………………… 59

2-8-1- روش تشكيل بيوفيلم روي اسلايدهاي شيشه‌اي به منظور رديابي تشکيل بيوفيلم……………………………………… 60

2-8-1-1- روش رنگ‌آميزي اسلايدهاي شيشه‌اي…………… 61

2-8-1-2- روش شمارش و شناسايي باكتري‌هاي متصل به سطح اسلايد  61

2-8-2- تعيين كمي تشكيل بيوفيلم و مقايسه‌ي بين قدرت باكتري‌هاي ايزوله شده براي تشكيل بيوفيلم……………………………. 64

2-8-2-1- روش ميكروتيتر پليت براي تعيين كميت تشكيل بيوفيلم توسط باكتري‌ها……………………………………………. 64

2-8-3-بررسي ساختار بيوفيلم ها توسط ميکروسکوپ الکتروني اسکنينگ 67

2-8-3-1-  تهيه نمونه براي ميکروسکوپ الکتروني اسکنينگ 67

2-8-3-2- مکانيسم هاي تصوير سازي توسط ميکروسکوپ الکتروني   67

2-8-3-2-1- مکانيسم SE…………………………. 67

2-8-3-2-2- مکانيسم BSE ……………………….. 68

2-9- روش‌ به كار رفته در ارزيابي قدرت حذف و يا ازبين بردن سلول‌هاي مولد بيوفيلم توسط عوامل ضد ميكروبي………………….. 68

2-9-1- تهيه‌ي بيوسايدها با رقت‌هاي مورد نظر بر حسب ppm      69

2-9-1-1-  تهيه‌ي رقت از بيوسايدهاي مايع………….. 69

2-9-1-2- تهيه‌ي رقت از بيوسايدهاي جامد…………… 70

2-9-1-3- روش انجام آزمايش ميكروتيتر پليت براي تعيين پتانسيل حذف بيوفيلم توسط بيوسايدها……………………………….. 70

2-9-2- روش ميكروتيتر پليت براي تعيين پتانسيل كشتن سلول‌هاي مولد بيوفيلم توسط بيوسايدها……………………………….. 71

2-9-2-1-  تهيه‌ي رنگ تري فنيل تترازوليوم كلرايد 2%… 72

2-9-2-2- روش انجام آزمايش ميكروتيترپليت براي تعيين پتانسيل كشتن سلول‌هاي مولد بيوفيلم و موجود در آن توسط عوامل ضد‌ميكروبي….. 73

فصل سوم: نتايج و مشاهدات……………………. 74

3-1- جداول شناسايي و تست هاي بيوشيمي سويه هاي ايزوله شده  75

3-1-1- باسيلوس ها…………………………….. 75

3-1-2- ميکروکوکوس لوتئوس………………………. 75

3-1-3- اسينتوباکتر ها…………………………. 76

3- 2- نتايج مربوط به تعيين هيدروفوبيسيتي سطح سلول ها 77

3-2-1- نتايج مربوط به تعيين هيدروفوبيسيتي سطح سلول هاي پلانکتونيک   77

3-2-2- نتايج مربوط به سنجش هم اتصالي بين سويه ميکروکوکوس لوتئوس با ساير باکتري ها……………………………………. 78

3-2-3- نتايج مربوط به سنجش هيدروفوبيسيتي سطح سلول هاي موجود در بيوفيلم……………………………………………. 79

3-3- نتايج حاصل از روش ميکروتيتر پليت براي تعيين کميت تشکيل بيوفيلم و مقايسه بين قدرت باکتري هاي ايزوله شده براي تشکيل بيوفيلم  80

3-4- نتايج مربوط به رديابي تشکيل بيوفيلم توسط ميکروسکوپ نوري  81

3-5- نسبت رشد سلول ها درون بيوفيلم در مدت زمان 24 ساعت    84

3-6- نتايج مربوط به مقايسه اتصال باکتري ها در بيوفيلم مخلوط به سطح اسلايد شيشه اي……………………………………… 84

3-7-  نتايج مربوط به بررسي بيوفيلم باکتري ها توسط ميکروسکوپ الکتروني اسکنينگ……………………………………… 86

3-8-  نتايج مربوط به تعيين پتانسيل حذف بيوفيلم و کشتن سلول هاي درون بيوفيلم توسط بيوسايد ها……………………….. 91

3-8-1- اثر حذفي( ستون هاي CV) و کشندگي(ستون هاي TTC) هيپوکلريت سديم در غلظت هاي مختلف روي بيوفيلم باکتري ها به طور جداگانه و روي بيوفيلم مخلوط باکتري ها(سويه هاي اسينتوباکتر، باسيلوس و ميکروکوکوس با هم)   91

3-8-2- اثر حذفي( ستون هاي CV) و کشندگي(ستون هاي TTC)H₂O₂ در غلظت هاي مختلف روي بيوفيلم باکتري ها به طور جداگانه و روي بيوفيلم مخلوط باکتري ها(سويه هاي اسينتوباکتر، باسيلوس و ميکروکوکوس با هم) 95

3-8-3- اثر حذفي( ستون هاي CV) و کشندگي(ستون هاي TTC) گلوتار آلدهيد در غلظت هاي مختلف روي بيوفيلم باکتري ها به طور جداگانه و روي بيوفيلم مخلوط باکتري ها(سويه هاي اسينتوباکتر، باسيلوس و ميکروکوکوس با هم)   98

3-8-4- اثر حذفي( ستون هاي CV) و کشندگي(ستون هاي TTC) سولفاتيازول در غلظت هاي مختلف روي بيوفيلم باکتري ها به طور جداگانه و روي بيوفيلم مخلوط باکتري ها(سويه هاي اسينتوباکتر، باسيلوس و ميکروکوکوس با هم) 101

3-8-5- اثر حذفي( ستون هاي CV) و کشندگي(ستون هاي TTC) آلکيل دي متيل بنزيل آمونيوم کلرايد در غلظت هاي مختلف روي بيوفيلم باکتري ها به طور جداگانه و روي بيوفيلم مخلوط باکتري ها(سويه هاي اسينتوباکتر، باسيلوس و ميکروکوکوس با هم)………………………………………. 104

فصل چهارم: بحث……………………………. 107

4-1- بررسي هيدروفوبيسيتي سطح سلول هاي پلانکتونيک….. 107

4- 2-بررسي هم اتصالي بين سويه ميکروکوکوس لوتئوس با ساير باکتري ها  109

4-3- بررسي هيدروفوبيسيتي سطح سلول هاي موجود در بيوفيلم    110

4-5- بررسي اتصال باکتري ها به سطوح مورد آزمايش…… 112

4-6- بررسي و رديابي تشکيل بيوفيلم………………. 113

4-7- بررسي رشد سلول ها درون بيوفيلم…………….. 116

4-8- بحث و بررسي در مورد تعيين پتانسيل حذف بيوفيلم و کشتن سلول هاي درون بيوفيلم توسط بيوسايد ها……………………….. 117

4-9- بررسي مدل نفوذ بيوسايد به درون بيوفيلم……… 121

جمع بندی نهايی……………………………….. 123

پيشنهادات……………………………………. 124

فصل پنجم: منابع و مأخذ……………………… 125

 

فهرست شکل ها

عنوان                                                                                                                      صفحه

فصل اول: مقدمه

شکل 1-1- ……………………………………. 11

فصل دوم: مواد و روش ها

شکل 2-1-…………………………………….. 46

شکل 2-2-…………………………………….. 46

شکل 2-3-…………………………………….. 50

شکل 2-4-…………………………………….. 51

شکل 2-5-…………………………………….. 52

شکل2-6-……………………………………… 53

شکل2-7-……………………………………… 64

فصل سوم: نتايج

شکل 3-1-…………………………………….. 77

شکل 3-2-…………………………………….. 78

شکل 3-3-…………………………………….. 79

شکل 3-4-…………………………………….. 80

شکل 3-5-…………………………………….. 81

شکل 3-6-…………………………………….. 82

شکل 3-7-…………………………………….. 82

شکل 3-8-…………………………………….. 83

شکل 3-9-…………………………………….. 83

شکل 3-10-……………………………………. 84

شکل 3-11-……………………………………. 85

شکل 3-12-……………………………………. 86

شکل 3-13-……………………………………. 87

شکل 3-14-……………………………………. 88

شکل 3-15-……………………………………. 89

شکل 3-16-……………………………………. 89

شکل 3-17-……………………………………. 90

شکل 3-18-……………………………………. 92

شکل 3-19-……………………………………. 93

شکل 3-20-……………………………………. 94

شکل 3-21-……………………………………. 95

شکل 3-22-……………………………………. 96

شکل 3-23-……………………………………. 97

شکل 3-24-……………………………………. 98

شکل 3-25-……………………………………. 99

شکل 3-26-……………………………………. 100

شکل 3-27-……………………………………. 101

شکل 3-28-……………………………………. 102

شکل 3-29-……………………………………. 103

شکل 3-30-……………………………………. 104

شکل 3-31-……………………………………. 105

شکل 3-32-……………………………………. 106

فهرست جدول ها

عنوان                                                                                                                       صفحه

فصل اول: مقدمه

جدول 1-1-……………………………………. 17

جدول  1-2-…………………………………… 18

جدول 1-3-……………………………………. 23

جدول 1-4-……………………………………. 24

جدول 1-5-……………………………………. 25

جدول 1-6-……………………………………. 37

فصل سوم: نتايج

جدول 3- 1-…………………………………… 75

جدول 3- 2-…………………………………… 76

جدول 3- 3-…………………………………… 76

جدول 3-4-……………………………………. 80

جدول 3-5-……………………………………. 85