القای تتراپلوئیدی و بررسی اثر آن بر قابلیت باززایی و تراریزش توسط Agrobacterium rhizogenes در گیاه کاسنی (Cichorium intybus L.).

 فهرست مطالب

1- مقدمه 1

1-1- معرفی گیاه کاسنی2

1-2- ارزش دارویی و اقتصادی کاسنی2

1-3- مروری بر متابوليت‌هاي ثانويه گياهي3

1-3-1- تاریخچه3

1-3-2- ویژگی و عملکرد متابولیت­های ثانویه گیاهی4

1-3-3- طبقه­بندی متابولیت­های ثانویه گیاهی4

1-3-3-1- ترپنوئیدها5

1-3-3-2- آلکالوئیدها5

1-3-3-3- فنول­های گیاهی5

1-3-3-3-1- کلروژنیک اسید6

1-4- پلي‌پلوئيدي مصنوعي (دستورزي عدد کروموزومي)7

1-4-1- اتو‌پلي‌پلوئيدي 8

1-4-2- آلو‌پلي‌پلوئيدي 10

1-4-3- پلي‌پلوئيدي و تغييرات شيميايي 10

1-4-4- فلوسيتومتري (FCM)12

1-5- کشت‌هاي ريشه موئين 13

1-5-1- مقدمه13

1-5-2- بيولوژي آگروباکتريوم رايزوژنز 13

1-5-3- ژن‌هاي دخيل در انتقال ژن با واسطه‌گري آگروباكتريوم 15

1-5-4- ويژگي‌هاي ريشه موئين 17

1-5-5- کشت‌هاي ريشه موئين به عنوان منبع متابوليت‌هاي ثانويه 18

1-5-6- کاربردها و چشم‌اندازهاي بيوتکنولوژي کشت‌هاي ريشه موئين19

1-6- روش‌هاي تاييد تراریزش به واسطه‌ی آگروباکتریوم رایزوژنز 20

1- 6-1- واکنش زنجيره‌اي پليمراز (PCR)21

1-7- ریشه‌های موئین تترا‌پلوئید21

1-8- کشت بافت گیاهی22

1-8-1- تاریخچه22

1-8-2- کشت بافت گیاهان دارویی 23

1-8-3- کشت بافت کاسنی 24

1-9- اهداف پژوهش 25

2- مواد و روش‌ها26

2-1- القای تتراپلوئيدي27

2-1-1- مواد و وسایل مورد نیاز ‌27

2-1-2- روش‌های القای تتراپلوئيدي‌27

2-1-2-1- تیمار بذر‌‌ها ‌27

2-1-2-2- تیمار مریستم رأسی نوشاخه‌ها‌27

2-1-3- بررسی‌های ساختاری گیاهان تیمار و شاهد 28

2-1-3-1- مواد و وسایل مورد نیاز 28

2-1-3-2- اندازه‌گیری ابعاد سلول‌های نگهبان روزنه به منظور انتخاب اولیه‌ی‌ پلی‌پلوئید‌ها29

2-1-4- آنالیز‌ فلوسیتومتری گیاهان شاهد و پلی‌پلوئید‌های احتمالی 29

2-1-4-1- مواد و وسایل مورد نیاز 29

2-1-4-2- آماده ‌سازی نمونه‌ها و نحوه‌ی انجام آنالیز‌ فلوسیتومتری 29

2-1-5- مقایسه‌ی ویژگی­های ریخت شناسی و ساختاری گیاهان تتراپلوئید و شاهد30

2-1-5-1- مواد و وسایل لازم 30

2-1-5-2- روش مقایسه‌ی برخی ویژگی‌های ریخت‌شناسی وساختاری گیاهان تترا‌پلوئید و شاهد30

2-1-5-2-1- اندازه‌گیری طول و عرض سلول‌های نگهبان روزنه و شمارش کلروپلاست‌های موجود در آن‌ها 30

2-1-5-2-2- اندازه‌گیری قطر دانه‌ها‌ی گرده 30

2-1-5-2-3- مقایسه‌ی طول و عرض برگ‌ گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید31

2-1-5-2-4- مقایسه‌ی برش عرضی برگ گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید 31

2-2- القای و تثبیت ريشه‌هاي مويين 31

2-2-1- مواد و وسایل مورد نیاز 31

2-2-2- آماده سازی باکتری جهت تلقیح 31

2-2-2-1- تهیه‌ی محلول ذخیره‌ی آنتی‌بیوتیک ریفامپین 31

2-2-2-2- تهیه‌ی محیط کشتLB 32

2-2-2-3- کشت باکتری 32

2-2-3- آماده سازي ريزنمونه‌ها براي تلقيح 32

2-2-4- تلقيح باکتريایی32

2-2-4-1- تهیه‌ی محلول ذخیره‌ی استوسیرینگون 32

2-2-4-2- تهیه‌ی محیط کشتMS 32

2-2-4-2-1- تهیه‌ی محلول‏های ذخیره 33

2-2-4-2-1-1- تهیه‌ی محلول ذخیره عناصر پرمصرف 33

2-2-4-2-1-2- تهیه‌ی محلول ذخیره عناصر کم‎مصرف 33

2-2-4-2-1-3- تهیه‌ی محلول ذخیره کلات آهن33

2-2-4-2-1-4- تهیه‌ی محلول ذخیره ویتامین‎ها 33

2-2-4-2-2- تهیه‌ی محیط کشت33

2-2-4-3- تلقیح باکتریایی ریزنمونه‌ها 34

2-2-5- حذف باکتري34

2-2-5-1- تهیه‌ی محلول ذخیره‌ی آنتی‌بیوتیک سفوتاکسیم34

2-2-5-2- باکتری‌زدایی از ریز‌نمونه‌ها34

2-2-6- تثبيت کشت‌هاي ريشه موئين 34

2-2-7- القای ریشه‌های موئین در برگ‌های لپه‌ای کاسنی دیپلوئید35

2-2-8- تیمار ریشه‌های موئین دیپلوئید با محلول کلشی‌سین35

2-2-8-1- مواد و وسایل مورد نیاز 35

2-2-8-2- تیمار ریشه‌های موئین دیپلوئید در محیط کشت MS مایع حاوی کلشی‌سین35

2-2-9- استخراج DNA ژنومی36

2-2-9-1- مواد و وسایل مورد نیاز 36

2-2-9-2- استخراج DNA ژنومی از ریشه‌های معمولی و موئین کاسنی36

2-2-10- تعیین کیفیتDNA  از طریق انجام الکتروفورز 36

2-2-10-1- مواد و وسایل مورد نیاز 36

2-2-10-2- روش تهیه‌ی محلول ذخیره‌یEDTA 36

2-2-10-3- روش تهیه‌ی محلول ذخیره‌یTAE 36

2-2-10-4- روش تهیه‌ی ژل آگارز 36

2-2-10-5- روش الکتروفورز افقی 37

2-2-11- انجام PCR37

2-2-11-1- مواد و وسایل مورد نیاز 37

2-2-11-2- کلونی PCR برای ژنrol B 37

2-3- مطالعات بيوشيميايي38

2-3-1- اندازه­گيري ميزان ترکيبات فنولي کل38

2-3-1-1- مواد و وسایل مورد نیاز38

2-3-1-2- استخراج و اندازه­گيري ميزان ترکيبات فنولي38

2-3-1-2-1- رسم منحني استاندارد 39

2-3-2- اندازه­گيري ميزان کلروژنیک اسید (CGA)39

2-3-2-1- مواد و وسایل مورد نیاز 39

2-3-2-2- استخراج کلروژنیک اسید 39

2-3-2-3- اندازه­گیری CGA با روش کروماتوگرافی مایع باکارایی بالا (HPLC) 40

2-3-2-3-1- رسم منحني استاندارد 40

2-4- کشت بافت گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید40

2-4-1- مواد و وسایل مورد نیاز 40

2-4-2- تهیه‌ی محلول ذخیره تنظیم کننده‎های رشد41

2-4-3- کشت درون شیشه گیاهان 41

2-4-3-1- سترون سازی و کشت ریزنمونه‌ها به منظور کالوس‎زایی41

2-4-3-2- انتقال کالوس‌ها به محیط شاخسار‎زایی42

2-4-3-3- انتقال نوشاخه‌های باززایی شده به محیط ریشه‎زایی42

2-4-3-4- بررسی سطح پلوئیدی کالوس‌ها 42

2-4-4- القای ریشه‌های موئین در کالوس‌ها42

2-5- عملیات آماری42

3- نتایج 44

3-1- القای پلی‌پلوئیدی در گیاهان45

3-1-1- القای پلی‌پلوئیدی در بذر‌های تیمار شده با کلشی‌سین45

3-1-2- القای پلی‌پلوئیدی در گیاهچه‌های تیمار شده با کلشی‌سین 45

3-1-3- نتایج آزمایشات فلوسیتومتری 46

3-1-4- مقایسه‌ی برخی ویژگی‌های ریخت‌شناختی میان گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید48

3-1-4-1- اندازه‌ی سلول‌های نگهبان روزنه و تعداد کلروپلاست‌های موجود در آن‌ها48

3-1-4-2- اندازه‌ی گل و دانه‌های‌ گرده48

3-1-4-3- اندازه‌ی برگ49

3-1-4-4- برش عرضی برگ 49

3-1-5- گلدهی گیاهان شاهد و تتراپلوئید49

3-2- القای ريشه‌هاي موئين49

3-2-1- القای ریشه‌های موئین در گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید کاسنی49

3-2-2- القای ریشه‌های موئین در برگ‌های لپه‌ای گیاهچه‌های 8 روزه‌ی کاسنی دیپلوئید50

3-2-3- تیمار ریشه‌های موئین دیپلوئید در محیط کشت دارای کلشی‌سین50

3-2-4- بررسی ماهیت تراریخته‌ی ریشه های موئین50

3-3- مطالعات بیو‌شیمیایی51

3-3-1- ترکیبات فنولی کل51

3-3-2- کلروژنیک اسید51

3-4- کشت بافت گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید52

3-4-1- کالوس‏زایی ریزنمونه‌های برگی 52

3-4-2- شاخسار‌زایی و ریشه‌زایی در کالوس‌های دیپلوئید، تتراپلوئید وشیمر52

3-4-3- تعیین سطح پلوئیدی کالوس‌های به دست آمده از گیاهان دیپلوئید، تتراپلوئید و شیمر53

3-5- القای ریشه‌های موئین در کالوس‌ها53

4- بحث54

4-1- القای پلی‌پلوئیدی55

4-1-1- القای پلی‌پلوئیدی در بذر‌های تیمار شده با کلشی‌سین 55

4-1-2- القای پلی‌پلوئیدی در گیاهچه‌های تیمار شده با کلشی‌سین 55

4-1-3- مقایسه‌ی برخی ویژگی‌های ریخت‌شناسی میان گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید59

4-1-4- افزایش میزان ترکیبات فنولی و کلروژنیک اسید در برگ‌های تتراپلوئید60

4-1-5- گلدهی و دانه‌دهی61

4-2- القای ریشه‌های موئین61

4-2-1- مقایسه‌ی قابلیت تراریزش ریزنمونه‌های به دست آمده از گیاهان مسن و جوان61

4-2-2- القای ریشه موئین در کالوس63

4-2-3- تیمار کلشی سین ریشه‌های موئین63

4-2-4- مقایسه‌ی میزان ترکیبات فنولی و کلروژنیک اسید در ریشه‌های معمولی و موئین64

4-3- کشت بافت گیاهان دیپلوئید و تترا‌پلوئید65

4-3-1- کالوس‏زایی ریزنمونه‌های برگی مختلف65

4-3-2- شاخسار‌زایی و ریشه‌زایی در کالوس‌های دیپلوئید، تتراپلوئید و شیمر 65

4-3-3- تعیین سطح پلوئیدی کالوس‌های به دست آمده از گیاهان دیپلوئید، تتراپلوئید و شیمر68

4-4- نتیجه‌گیری68

4-5- پیشنهادات69

5- پیوست‌ها77

5-1- جدول‌ها77

جدول 1-172

جدول 2-173

جدول 2-273

جدول 2-374

جدول 3-174

5-2- شکل‌ها75

شکل 1-175

شکل 1-275

شکل 1-376

شکل 2-176

شکل 2-276

شکل3-1 76

شکل 3-277

شکل 3-377

شکل 3-478

شکل 3-578

شکل 3-678

شکل 3-7 79

شکل 3-879

شکل 3-979

شکل 3-1080

شکل 3-1180

شکل 3-1280

شکل 3-1381

شکل 3-1481

شکل 3-1582

شکل 3-1682

شکل3-17 82

شکل 3-1883

شکل 3-1983

شکل 3-2083

شکل 3-2184

شکل 3-2284

شکل 3-2384

شکل 3-2485

شکل 3-2585

شکل 3-2685

شکل 3-2786

شکل 3-2886

شکل 3-2986

شکل 3-3087

شکل 3-3187

شکل 3-3287

شکل 3-3387

شکل 3-3488

5-3- نمودار‌ها89

نمودار 3-189

نمودار‌ 3-289

نمودار‌ 3-389

نمودار 3-490

نمودار‌ 3-590

نمودار‌ 3-690

نمودار‌ 3-790

نمودار‌ 3-890

نمودار‌ 3-991

نمودار‌ 3-1091

نمودار‌ 3-1191

نمودار‌ 3-1291

نمودار 3-1391

نمودار 3-14‌91

6- منابع