%31تخفیف

استفاده از لايهي سطحي باسيلوسها به عنوان داربست براي کشت سلولهاي PC12

تعداد 109صفحه در فایل word

کارشناسي ارشد رشته زيستشناسي گرايش ميکروبشناسي

استفاده از لايهي سطحي باسيلوسها به عنوان داربست براي کشت سلولهاي PC12

چکيده :

امروزه يکي از چالش بسيار مهم در عرصه مهندسي بافت، بهينه کردن داربستها جهت جداسازي، تکثير و تمايز سلولها ميباشد. در اين زمينه تحقيقاتي در سطح دنيا انجام شده است و از پليمرهاي گوناگوني جهت نيل به اين هدف بهره برده شده است.

در بحث مربوط به داربست خصوصياتي مد نظر ميباشد که در اين زمينه محققان بسياري تحقيق کردهاند. از آن جمله ميتوان موارد زير را نام برد: قدرت مکانيکي جهت تقليد از شرايط موجود زنده، زيست سازگاري و زيست تخريب پذيري، درصد تخلخل بالا، توانايي فراهم کردن سيگنالهاي شيميايي مناسب جهت هدايت رشد بافت، عدم تحريک پاسخهاي سمي، توانايي توليد در اندازه و شکلهاي مناسب براي جايگزيني در بافت هدف، توانايي تاثير به روي ژنهاي سلولها جهت افزايش تکثير و تمايز در ترميم بافت، توانايي ايجاد هم کنشهاي اختصاصي با ساير سلولها.

نانو داربستها شامل نانو فيبرها و فيبرهاي پروتئيني خود مجتمع شونده هستند. در اين محيطها فيبرها بايد کوچکتر از سلولها باشند، تا اينکه سلولها توسط داربست در برگرفته شوند، همانند ماتريکس خارج سلولي طبيعي.

در اين تحقيق برآنيم تا براي اولين بار لايه سطحي Bacillus coagulans HN-68 و Bacillus thuringiensis MH14 و پارااسپورال باديBacillus thuringiensis MH14 را جهت استفاده به عنوان داربست براي کشت بافت بررسي کنيم. از خصوصيات مهم S-Layer ميتوان قابليت تجزيهي زيستي، خود تجمعي و خود سامان دهي، ساختار شفاف و سه بعدي آن و ضخامت در حد نانو را نام برد، همچنين منافذ موجود در اين لايه داراي اندازه و شکل يکسان هستند. از طرفي پايداري و در دسترس بودن اين روش، مقاومت در مقابل آنزيمهاي پروتئوليتيک و مقاومت خوب در مقابل آنزيمهاي صفراوي، عصاره پانکراس و گراديان pH اين روش را به روشي ممتاز جهت استفاده به عنوان داربست در کشت بافت مبدل کرده است. همچنين تاکنون گزارشي در مورد سميت و آلر‌‌ژي زايي آن ارائه نشده است.

در اين مطالعه با روش نو و ساده رنگآميزي با کوماسيبلو و ميکروسکوپ نوري و همچنين تکنيکهاي AFM، FTIR، XRD و مطالعات بيوانفورماتيکي اين سه پروتئين مطالعه شدند و در نهايت لايه سطحي و لاشهي Bacillus coagulans HN-68 جهت استفاده به عنوان داربست براي کشت سلولهاي PC12 انتخاب شدند. با استفاده از تکنيک MTS سميت داربستها بررسي شد به علاوه چسبندگي سلولها با استفاده از ميکروسکوپ نوري مشاهده و در نهايت با بهره گيري از روش رنگآميزي DAPI هسته سلولها شمارش شد.

نتايج حاکي از آن بود که حضور يون کلسيم از طريق اتصال به گروههاي کربوکسيل و اتمهاي نيتروژن لايزين، آسپاراژين، هيستيدين و زنجيره پپتيدي منجر به افزايش کريستالهشدن لايهS و تغيير ساختار دوم آن ميشود، بهعلاوه سطح داخلي لايهS بيشتر بار منفي و سطح خارجي آن بيشتر بار مثبت دارد. در نهايت لايهS Bacillus coagulans HN-68 ميتواند بستر مناسبي براي اتصال و تکثير سلولهاي PC12 باشد بهخصوص اگر کف پليت کشت سلول ابتدا توسط PLO با بار مثبت تيمار شود.

کليد واژهها: داربست، S-Layer، پارااسپورالبادي، PC12 ، Bacillus coagulans HN-68 ، Bacillus thuringiensis MH14

دسته: زیست شناسی, علوم تجربی برچسب: Bacillus coagulans HN-68, Bacillus thuringiensis MH14, PC12, S-Layer, پارااسپورالبادي, کليد واژهها: داربست

توضیحات
نظرات (0)

فهرست مطالب

عنوان صفحه

چکيده :.. 7

1- فصل اول-مقدمه

1-1- مقدمهاي بر داربستهاي سلولي و مهندسي بافت.. 3

1-1-1- مهندسي بافت.. 3

1-1-2- پيوند از خود.. 4

1-1-3- پيوند از ديگري.. 4

1-2- ويژگي داربستهاي سلولي مورد استفاده در مهندسي بافت 5

1-2-1- زيست سازگاري.. 6

1-2-2- زيست تخريب‌پذيري.. 6

1-2-3- متخلخل بودن.. 6

1-2-4- خواص مکانيکي.. 6

1-2-5- تشکيل بافت جديد.. 6

1-2-6- قابليت سترون شدن.. 6

1-3- مواد مورد استفاده در ساخت داربستهاي کشت سلول.. 7

1-3-1- پليمرهاي تخريب پذير سنتزي.. 7

1-3-1-1- پلي استرها.. 7

1-3-2- مواد معدني مصنوعي.. 9

1-3-3- پليمرهاي طبيعي.. 10

1-4- روشهاي ساخت داربستهاي سلولي.. 11

1-4-1- کشش.. 11

1-4-2- سنتز در قالب.. 13

1-4-3- جداسازي فاز.. 14

عنوان صفحه

1-4-4- خودآرايي.. 15

1-4-5- الکتروريسي.. 16

1-5- مزيت داربستهاي خود آرايهي پپتيدي به دار بستهاي پليمري 19

1-6- لايه سطحي باکتريها و خصوصيات آن.. 19

1-6-1- کاربرد S-Layer در نانو بيو تکنولوژي.. 21

1-6-2- بيو مارکر فلورسنت.. 22

1-6-3- چند مثال از S-Layer ها و برخي خصوصيات آنها.. 23

1-7- پارا اسپورال بادي و خصوصيات آن.. 24

2- فصل دوم- مواد و روشها

2-1- دستگاههاي مورد استفاده.. 26

2-2- مواد مورد استفاده.. 27

2-2-1- مواد مورد استفاده در استخراج پروتئين ، SDS PAGE و رنگآميزي پروتئين… 27

2-2-2- مواد مورد استفاده در کشت سلول… 28

2-3- نحوه ي ساخت مواد.. 29

2-3-1- ساخت محيط کشت NA (Merk) 29

2-3-2- ساخت محيط کشت BHIB (Merk) 29

2-3-3- روش ساخت معرف برادفورد.. 29

2-3-4- روش ساخت GHCl 5 مولار.. 30

2-3-5- روش ساخت CaCl₂10 ميلي مولار.. 30

2-3-6- روش ساخت محلول هاي SDS PAGE.. 30

2-3-7- روش ساخت محيط کشت براي کشت سلولهاي PC12. 32

2-4- کشت و نگهداري باکتريهاي B.coagulans HN-68 و B. thuringiensis MH14. 33

2-5- استخراج لايه سطحي.. 33

عنوان صفحه

2-6- دياليز.. 34

2-7- تکنيک برادفورد .. 34

2-8- تکنيک SDS PAGE.. 35

2-8-1- روش رنگ آميزي کوماسي بلو.. 37

2-9- آماده سازي نمونه جهت مطالعه ي پروتئين با ميکروسکوپ نوري 37

2-10- آماده سازي نمونه جهت بررسي با ميکروسکوپ AFM… 38

2-11- آماده سازي نمونه جهت آناليز XRD.. 38

2-12- آماده سازي نمونه جهت آناليز FTIR.. 38

2-13- روش هاي مطالعه پارا اسپورال بادي.. 39

2-13-1- سويه باکتري و شرايط کشت.. 39

2-13-2- آماده سازي نمونه ي کريستال/اسپور براي بررسي با ميکروسکوپ نوري 39

2-13-3- جداسازي و خالص سازي پارااسپورال بادي.. 39

2-14- مطالعات بيوانفورماتيکي .. 39

2-15- آزمايشهاي کشت سلولي.. 40

2-15-1- آماده سازي نمونه ها براي آزمايش هاي کشت سلول.. 40

2-15-2- آماده سازي فلاسک کشت سلول براي کشت سلولهاي PC12. 40

2-15-3- ذوب و کشت سلولهاي PC12. 41

2-15-4- پاساژ سلولهاي PC12. 41

2-15-5- کشت سلول بر داربستها.. 42

2-15-6- آناليزMTS. 42

2-15-7- مشاهده اتصال و مورفولوژي سلولها با استفاده از ميکروسکوپ نوري 43

2-15-8- مشاهده مورفولوژي و تکثير سلولها با استفاده از ميکروسکوپ فلورسنت.. 44

2-15-9- شمارش هسته سلول.. 44

عنوان صفحه

2-15-10- آناليزهاي آماري.. 44

3- فصل سوم نتايج

3-1- آناليز SDS PAGE.. 46

3-2- بررسي تاثير يون کلسيم بر ساختار و خودآرايه لايه سطحي 47

3-3- تاثير بستر جامد برخودآرايهي لايه سطحي.. 49

3-4- آناليز FTIR.. 52

3-4-1- تاثير اتصال کلسيم بر طيف FTIR لايه سطحي.. 52

3-4-2- تاثير اتصال يون کلسيم بر ساختار دوم پروتئين لايه سطحي B.coagulans HN-68 و B.thuringiensis MH14. 55

3-4-3- توزيع بار در سطح داخلي و خارجي لايهي سطحي B.thuringiensis MH14. 57

3-4-4- توزيع بار در سطح داخلي و خارجي لايهي سطحي B.coagulans HN–68. 61

3-5- آناليز XRD.. 63

3-6- مطالعه ي پارااسپورال بادي.. 64

3-6-1- بررسي مرفولوژي پارااسپورال بادي.. 64

3-6-2- بررسي ساختار سه بعدي و تعيين جايگاه حفره در Cry4Ba. 66

3-6-3- پيش بيني افزايش مقاومت در Cry4Ba بر اساس جهش نقطه اي در يک اسيدآمينه.. 69

3-7- آناليز MTS. 75

3-8- تصاوير ميکروسکوپ نوري از سلولهاي PC12. 79

3-9- شمارش هسته سلولها.. 80

4- فصل چهارم– بحث و نتيجه گيري

4-1- تاثير يون کلسيم، ليوفليزه کردن و بستر جامد برخودآرايه ي لايه سطحي 83

4-2- شناسايي جايگاه اتصال يون کلسيم بر لايه سطحي.. 83

4-3- تاثير اتصال يون کلسيم بر ساختار دوم لايه سطحي B.coagulans HN-68 و B.thuringiensis MH14. 84

عنوان صفحه

4-4- توزيع بار در سطح داخلي و خارجي لايه سطحي B.thuringiensis MH14. 85

4-5- توزيع بار در سطح داخلي و خارجي لايه سطحي B.coagulans HN-68. 85

4-6- تفسير الگوي XRD.. 86

4-7- مطالعه ي پارااسپورال بادي.. 87

4-8- استفاده از S-Layer به عنوان داربست سلول و تحليل دادههاي MTS 88

4-9- تصاوير ميکروسکوپ نوري از سلولهاي PC12. 90

4-10- رنگ آميزي DAPI. 90

4-11- نتيجه گيري کلي.. 91

4-12- پيشنهادات.. 92

پيوست ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….93

منابع.. 95

فهرست اشکال

عنوان صفحه

شکل ‏1‑1: رابطه شماتيک بين اجزاء مختلف در مهندسي بافت… 4

شکل ‏1‑2: ساختمان ماتريکس خارج سلولي .. 5

شکل ‏1‑3: ساختار شيميايي PGA.. 8

شکل ‏1‑4: ساختار شيميايي PLA.. 9

شکل ‏1‑5: توليد نانوالياف به شيوه کشش… 12

شکل ‏1‑6: توليد نانوالياف به شيوه سنتز در قالب.. 13

شکل ‏1‑7: توليد نانوالياف به شيوه جداسازي فاز … 14

شکل ‏1‑8: پپتيد خودآرايه طراحي شده EAK16-II…. 15

شکل ‏1‑9: نماي کلي فرآيند الکتروريسي … 17

شکل ‏1‑10: ايجاد مخروط تيلور در فرايند الکتروريسي… 18

شکل ‏1‑11: تصوير شماتيک از پروتئين لايه سطحي استخراج شده از ديواره ي باکتري و خودآرايي آن… 20

شکل ‏1‑12: تصوير ميکروسکوپ AFM از S-Layer بر روي سيليکون . 22

شکل ‏3‑1: نمودار استاندارد غلظت پروتئين بر اساس روش برادفورد. 46

شکل ‏3‑2: نتايج SDS PAGEپروتئين لايه سطحي B.thuringiensis MH14 و B.coagulans HN68 47

شکل ‏3‑4: الف تصوير ميکروسکوپ نوري از لايهS B.coagulans HN-68 رنگ آميزي شده با کوماسي بلو G250 دياليز شده با آب دو بار تقطير . ب تصوير از لايهS B.coagulans HN-68 رنگ آميزي شده با کوماسي بلو G250 دياليز شده با آب دو بار تقطير.. 48

شکل ‏3‑3: لايه S از B.coagulans HN-68 ليوفليزه شده که عليه CaCl₂ دياليز شده است 48

شکل ‏3‑5: لايه S B.coagulans HN-68 دياليز شده با CaCl₂ 10 ميلي مولار تشکيل کريستال کمتر از نمونه ي ليوفليزه شده آن است … 49

شکل ‏3‑6: لايه ي سطحي B. thuringiensis MH14 که عليه CaCl₂ 10 ميلي مولار دياليز شده و با کوماسي بلو G250 رنگآميزي شده است.. 49

شکل ‏3‑7: الف کريستاله شدن لايه سطحي HN68 Bacillus coagulans بر سطح ميکا . ب کريستاله شدن لايه سطحي HN68 Bacillus coagulans بر سطح شيشه . ج کريستاله شدن لايه سطحي Bacillus thuringiensis MH14 بر سطح شيشه… 51

شکل ‏3‑8: تغييرات در طيف FTIR لايه سطحي HN-68 B .coagulans. 53

شکل ‏3‑9: تغييرات در طيف FTIR لايه سطحي MH14 B.thuringiensis طي اتصال کلسيم.. 54

عنوان صفحه

شکل ‏3‑10: نمودار FTIR نشاندهندهي تاثير اتصال يون کلسيم بر ساختار دوم پروتئين لايه سطحي B .coagulans HN–68 (الف) و B.thuringiensis MH14 (ب ). 56

شکل ‏3‑11: طيف FTIR از باکتري B.thuringiensis MH14، لايهي سطحي خالص B.thuringiensis MH14 و B.thuringiensis MH14 بعد از استخراج لايه ي سطحي در طيف.. 58

شکل ‏3‑12: طيف FTIR از باکتري B.coagulans HN-68 ، لايه ي سطحي خالص B.coagulans HN-68 و B.coagulans HN-68 بعد از استخراج لايه ي سطحي … 62

شکل ‏3‑13: الف- الگوي XRD سلولهاي رويشي B.coagulans HN-68 و B.thuringiensis MH14 . ب- الگوي XRD لايه سطحي متصل به کلسيم B.coagulans HN-68 و B.thuringiensis MH14. 63

شکل ‏3‑14: تصوير ميکروسکوپ نوري از لام تهيه شده از کشت کهنه ي Bacillus thuringiensis MH14 … 65

شکل ‏3‑15: تصوير ميکروسکوپ نوري از پارااسپورال بادي خالص، نشان دهنده تجمع کريستالهاي پروتئيني و تشکيل کريستال درشت پارا اسپورال بادي است . 66

شکل ‏3‑16: ساختار سه بعدي Cry4Ba… 67

شکل ‏3‑17: تعيين جايگاه و تعداد حفره ها در Cry4Ba با استفاده از نرمافزار Molegro…. 68

شکل ‏3‑18: پيش بينی جايگاه اتصال به فلزات در Cry4Ba. 69

شکل ‏3‑19: موقعيت قرار گيري Asp 451 در Cry4Ba . … 71

شکل ‏3‑20: نمودار فعاليت متابوليکي سلولها بر روي نمونه ها 1-12.. 76

شکل ‏3‑21: تصوير ميکروسکوپ نوري از سلولهاي PC12 بر بستر PLO/Laminin ( الف) و بر بستر PLO/ S-Layer (ب). … 79

شکل ‏3‑22: تصوير از هسته سلول هاي رنگ آميزي شده با رنگ DAPI . 81

شکل ‏4‑1- طرح شماتيک از نحوه ي آرايش لايه S بر سطح PLO با بار مثبت و اتصال سلول هاي PC12 به لايه S … 89

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول ‏1‑1- چند مثال از S-Layer ها و برخي خصوصيات آنها.. 23

جدول ‏2‑1- دستگاه هاي مورد استفاده.. 26

جدول ‏2‑2- مواد مورد استفاده در استخراج پروتئين ، SDS PAGE و رنگ آميزي پروتئين.. 27

جدول ‏2‑3- مواد مورد استفاده در کشت سلول.. 28

جدول ‏2‑4- مواد ساخت محيط کشت براي کشت سلول هاي PC12. 32

جدول ‏2‑5 – مواد تشکيل دهنده ژل Running. 35

جدول ‏2‑6- مواد تشكيل دهنده ژل Stacking. 36

جدول ‏3‑1- محتوي ناحيه ي amide I جهت محاسبه درصد نسبي ساختار دوم 55

جدول ‏3‑2-درصد ساختار دوم لايه سطحي دياليز شده با آب و کلسيم از B.coagulans HN-68و B.thuringiensis MH14… 56

جدول ‏3‑3- داده هاي FTIR از موقعيت باندهاي هيستيدين، لايزين، آسپارتيک اسيد و گلوتاميک اسيد در باکتري Bacillus thuringiensis MH14، لايه سطحي متصل و غير متصل به کلسيم از Bacillus thuringiensis MH14… 60

جدول ‏3‑4- نتايج سرور CUPSAT از ايجاد جهش نقطه اي بر اساس دناتوراسيون حرارتي در آسپارتيک اسيد موقعيت451… 72

جدول ‏3‑5– نتايج سرور CUPSAT از ايجاد جهش نقطه اي بر اساس دناتوراسيون شيميايي در آسپارتيکاسيد موقعيت451… 73

جدول ‏3‑6- نتايج پيشبيني جايگزينيASP موقعيت 451 با IEU در دو دماي C ° 37 و C ° 25 و pH 1 تا 8 با استفاده از سرور Mustab … 74

جدول ‏3‑7- کد داربستها.. 75

جدول ‏3‑8-آزمون کولموگروف- اسميرنوف.. 77

جدول ‏3‑9 – آزمون آناليز واريانس بين گروههاي مختلف داربست 78

جدول ‏3‑10- آزمون تعقيبي دانت براي مقايسه سطح معنا داري درصد حيات 12 گروه داربست با شاهد… 78

جدول ‏3‑11- نتايج ميانگين تعداد هسته هاي شمارش شده… 80

نقد و بررسی‌ها

هنوز بررسی‌ای ثبت نشده است.

اولین کسی باشید که دیدگاهی می نویسد “استفاده از لايهي سطحي باسيلوسها به عنوان داربست براي کشت سلولهاي PC12”

امتیاز 0 از 5 از 0 دیدگاه

قیمت اصلی 36,000 تومان بود.قیمت فعلی 25,000 تومان است.

تاریخ ایجاد بهمن 11, 1399
تاریخ بروزرسانی اسفند 13, 1401
فروش 0
دیدگاه 0

شرایط استفاده از محصول

تمام محصولات به ازای پرداخت پروژه تنها قابل استفاده می باشند. این بدین معنی است که برای استفاده از یک یا چند محصول ، لازم به خرید آن محصول است.

مزایای خرید این محصول:

دسترسی به فایل به صورت همیشگی
پشتیبانی رایگان
پشتیبانی 24 ساعته محصول
بازگشت وجه در صورت عدم رضایت مشتری

مشاهده قوانین سایت