بررسی پلی مورفیسم¬های T-786C و G894T در ژن آنزیم نیتریک اکسید سنتتاز اندوتلیالی (eNOS) و بررسی ارتباط آنان با سطح نیتریک اکسید سرمی در افراد سالم غیر خویشاوند استان لرستان

تعداد   119    صفحه در فایل   word

چکیده

 مقدمه: نیتریک اکسید دارای نقش‌هایی حیاتی همچون جلوگیری از تجمع پلاکت‌ها و کاهش اتصال لکوسیت­ها به سلول‌های اندوتلیال عروق، تنظیم عملکرد سلول‌های اندوتلیال و کنترل فشارخون است. این مولکول توسط آنزیم نیتریک اکسید سنتازاندوتلیالی در سلول‌های اندوتلیال سنتز می‌شود.

جایگاه ژن eNOS بر روی کروموزوم شماره 7 (7 q35-q36) قرار داشته و شامل 26 اگزون است. پلی مورفیسم­های ژن eNOS در اقوام و نژادهای گوناگون متفاوت بوده و انتظار می‌رود که وجود این پلی مورفیسم­ها کاهش سطح سرمی NO را به همراه داشته باشد. هدف از انجام این مطالعه بررسی شیوع دو پلی مورفیسم شایع ژن eNOS به نام‌های T-786C و G894 در استان لرستان در افراد سالم غیر خویشاوند بود. ارتباط بین این موتاسیون­ها و سطح سرمی نیتریک اکسید نیز بررسی شد.

روش انجام تحقیق: از دویست فرد غیر خویشاوند که سلامت آنان توسط پزشک متخصص تائید شده بود، با کسب رضایت آگاهانه خون‌گیری در ضد انعقاد EDTA به عمل آمد و بلافاصله استخراج DNA انجام شد. برای تشخیص پلی مورفیسم­ها از روش[1]PCR-RFLP استفاده شد. یک نمونه سرم نیز برای اندازه‌گیری سطح سرمی نیتریک اکسید با روش گریس گرفته می‌شد.

نتایج: شیوع ژنو تیپ‌های GG,GT, و TT در پلی مورفیسم G894T در 192 نمونه، به ترتیب 3/33,7/55 و 9/10 بود که در مقایسه اندازه NO بین این ژنو تیپ‌ها تفاوت معنی‌داری مشاهده نشد. در بررسی شیوع پلی مورفیسم T786C, فراوانی ژنو تیپ TT,TC و CC به ترتیب 1/40, 6/52 و 3/7 بود که سطح سرمی NO در این ژنو تیپ‌ها تفاوت معنی‌داری را با پلیمورفیسم نشان داد

بحث و نتیجه‌گیری:

شیوع پلی مورفیسم­های T-786C و G894T در افراد سالم استان لرستان تقریباً مشابه با شیوع در سایر نقاط جهان است.

لغات کلیدی: نیتریک اکسید، نیتریک اکسید سنتاز اندوتلیالی، پلی مورفیسم G894T، پلی مورفیسم T786C. استان لرستان

[1]Restriction fragment length polymorphism

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                        صفحه

فصل اولمقدمه ۱

۱-۱-ماهیت شیمیایی مولکول اکسید نیتریک.. ۲

۱-۲-وجود NOدر بدن و چگونگی سنتز آن. ۳

۱-۳- ایزو فرم‌های آنزیم نیتریک اکسید سنتاز ۵

۱-۴-تفاوت‌های بین ایزو فرم‌هایNOS. 7

۱-۵-دلایل وجود آنزیم‌هاگوناگون. ۱۰

۱-۶-ژن کد کننده eNOS و پلی مورفیسم های آن. ۱۲

۱-۷-سایر عوامل تنظیم‌کننده تولید نیتریک اکسید. ۱۳

۱-۸-عواملی که NO به‌وسیله آن‌ها اثرات زیستی خود را اعمال می‌کند. ۱۵

۱-۹-ویژگی‌هایآنزیم مورد هدف NO.. 18

۱-۱۰-محصول sGCو اثرات فیزیولوژیکی آن. ۱۹

۱-۱۱-مسیر سیگنالینگ برای NO و GMP حلقوی در سلول‌هایماهیچه‌ای صاف و پلاکت‌ها ۲۱

۱-۱۱-۱ سیگنالینگ NO در ماهیچه صاف.. ۲۱

۱-۱۱-۲-سیگنالینگ NO در پلاکت‌ها ۲۳

۱-۱۲-واکنش NOبا دیگرگونه‌های واکنش‌پذیر اکسیژن. ۲۶

۱-۱۲-۱-نیتروزاسیون گروه تیولپروتئین‌ها واهمیت آن. ۲۸

۱-۱۲-۲-تشکیل پروکسی نیتریت و اهمیت آن. ۳۰

۱-۱۳-NOSIII وفعالیت‌های ماکروفاژ ۳۱

۱-۱۴- نیتراسیون پروتئین‌ها تحت شرایط فیزیولوژیکی نرمال. ۳۲

۱-۱۵-اکسید نیتریک و تنظیم رشد سلولی و تولید پروتئین. ۳۴

۱-۱۶-اثر اکسید نیتریک روی بیان ژن. ۳۴

۱-۱۷-بیان مسئله ۳۵

۱-۱۸-اهداف.. ۳۶

۱-۱۹- جامعه‌ی موردمطالعه ۳۶

۱-۲۰- رعایت اصول اخلاقی پژوهش… ۳۷

۱-۲۱-تجزیه‌وتحلیل آماری: ۳۷

فصل دوم مواد و روش‌ها

۲-۱-مواد و دستگاه‌ها ۳۹

۲-۱-۱ مواد شیمیائی: ۳۹

۲-۱-۲-محلول‌ها ۳۹

۲-۱-۳-دستگاه‌ها ۴۰

۲-۲- روش کار ۴۱

۲-۲-۱-نمونه‌گیری. ۴۱

۲-۲-۲-روش استخراج DNA.. 42

۲-۲-۳-جداسازی گلبول‌های سفید با استفاده از فایکول. ۴۲

۲-۲-۴- استخراج DNA با استفاده از کیت.. ۴۳

۲-۳-بررسی کمی و کیفیDNAاستخراج‌شده ۴۶

۲-۳-۱-روش اسپکتوفتومتر. ۴۶

۲-۳-۲- روش نانودراپ.. ۴۷

۲-۳-۳-روش ژل الکتروفورز ۴۸

۲-۴-الکتروفورز ۴۸

۲-۴-۱-وسایل و مواد موردنیاز در الکتروفورز ۴۸

۲-۴-۲ آگارز ۴۹

۲-۴-۳-رنگ simply safe. 50

۲-۴-۴-ترکیبات وطرز تهیه TBE(Tris-borate-EDTA) 50

۲-۴-۵- Loading Buffer 51

۲-۴-۶-DNA سایز مارکر (Ladder) 51

۲-۴-۷-طرز تهیه ژل الکتروفورز ۵۲

۲-۴-۸-طریقه بارگذاری کردنRunning Procedure. 53

۲-۴-۹-روش کار دستگاه ژل داک (Gel Doc) 54

۲-۴-۱۰-شناسایی و بررسی باندها ۵۵

۲-۵-تکنیک Polymerase Chain Reaction) PCR) 55

۲-۵-۱-حداقل عوامل موردنیاز برای یک واکنش PCR. 56

۲-۵-۱-۱- DNA ی الگو. ۵۷

۲-۵-۱-۲- پرایمرهای Forward و Reverse 57

۲-۵-۱-۳-Taq polymerase 59

۲-۵-۱-۴-دزوکسی نوکلئونید تری فسفات‌ها (dNTPs) 60

۲-۵-۱-۵- بافرها وMgCl2. 60

۲-۵-۲-پارامترهای مؤثر در PCR. 61

۲-۵-۳- عواملی که موجب کاهش بازده PCRمی‌شوند. ۶۲

۲-۵-۴-تعیین دمای Annealing پرایمرها جهت PCRژن‌ها ۶۳

۲-۵-۵-انجام PCRSet Up در این مطالعه ۶۳

۲-۶-پروتکل PCR در این مطالعه ۶۵

۲-۷-تکنیکRFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 66

۲-۷-۱-پروتکل انجام RFLPژن‌هایموردمطالعه ۶۸

۲-۷-۲-بررسی پلی مورفیسم در پروموترژن eNOs درموقعیت T786C. 68

۲-۷-۳-بررسی پلی مورفیسم در پروموترژن eNOs درموقعیت G894T. 70

۲-۸-اندازه‌گیری نیتریک اکسید در خون. ۷۳

۲-۸-۱-مواد لازم برای ساخت معرف گریس… ۷۳

۲-۸-۲-طرز تهیه ۷۴

۲-۸-۳- روش تهیه منحنی استاندارد ۷۴

فصل سوم یافته‌ها

۳-۱-نتایج الکتروفورز جهت تائیدDNA استخراج‌شده: ۷۶

۳-۲- تعیین غلظت نمونه‌هایDNA با روش اسپکتروفتومتری. ۷۶

۳-۳-نتایج حاصل از PCR: 77

۳-۳-۱- PCR پلی مورفیسم G894T. 77

۳-۳-۲- PCR پلی مورفیسم T786C. 77

۳-۴-هضمتوسط آنزیم Ban II 79

۳-۵-هضم توسط آنزیم Msp I 79

۳-۶- نتایج حاصل از بررسی پلی مورفیسمG894T. 80

۳-۷-نتایج حاصل از بررسی درصد فراوانی ژنو تیپT786C. 81

۳-۸-نتایج حاصل از ارتباط سطح نیتریک اکسیددر خون با پلی مورفیسم G894T. 82

۳-۹-نتایج حاصل از ارتباط سطح نیتریک اکسید در خون با پلی مورفیسم T786C. 83

۳-۱۰-نتایج حاصل از بررسی NO در افرادی که دارای هردو موتانت هستند با افراد دارای یک نوع موتانت یا فاقد موتانت   ۸۴

فصل چهارم بحث و نتیجه‌گیری

۴-۱-بحث و نتیجه‌گیری. ۸۸

منابع. ۹۷

فهرست جدول‌ها

جدول ۲-۱- ترکیبات وحجم مواد مورد نیاز برای ساخت ۵۰۰لیتر محلول استوک بوریک اسید . ۵۰

جدول (۲-۲)- ترکیبات به کار رفته در لودینگ بافر. ۵۱

جدول ۲-۳- بعد از انجام گرادیانت دمایی بهترین دمای انلینگ و سایر مراحل PCR برای پلی مورفیسم G894T به صورت بالاانجام شد. ۶۴

جدول ۲-۴- برای پلی مورفیسم T786C بعد از انجام گرادیانت دمایی و انتخابمناسب‌ترین دمای انلینگ طبق جدول بالاPCR  انجام شد. ۶۴

جدول ۲-۵.برای انجام PCR ازMaster Mix آماده  استفاده شد و کل مواد واکنش PCR در پایان به حجم ۲۵ میکرولیتر می رسند. ۶۶

جدول ۲-۶-پرایمر های طراحی شده برای انجام PCR  برای هردو پلی مورفیسم. ۶۷

جدول ۲-۷-پروتکل هضم آنزیم MspI 68

جدول ۲-۸- قطعات حاصل از برش آنزیم MspI در پلی مورفیسم T786C. 70

جدول۲-۹-پروتکل هضم آنزیم BanII 71

جدول ۲-۱۰-قطعات حاصل از هضم آنزیمیBanII روی PCR پلی مورفیسم G894T. 72

جدول  ۳-۱- فراوانی به دست آمده از واریانت های پلی مورفیسم G894T در این مطالعه ۸۰

جدول ۳-۲- فراوانی  حاصل از بررسی واریانت های T786C در این مطالعه ۸۱

جدول۳-۳- میانگین NO بر میکرو مول بر لیتر در کل افراد در بین سه ژنو تیپG894T. 82

جدول ۳-۴- میانگین NOبرحسب میکرو مول بر لیتر در کل افراد در بین سه ژنو تیپT786C. 83

جدول ۳-۵- میانگین مقدار NO در افراد دارای موتانت از هر دو نوع پلی مورفیسم (کد۳), افراد دارای یک نوع موتانت(کد۲)  و فاقد موتانت (کد ۱) ۸۵

فهرست نمودارها

نمودار۳-۱-  نمودار فراوانی انواع زنوتیپ های پلی مورفیسم G894T در این مطالعه. ۸۱

نمودار ۳-۲-نمودار  فراوانی انواع ژنوتیپ های پلی مورفیسم T786C در این مطالعه ۸۲

نمودار ۳-۳- نمودار میانگین مقدار NO در هریک از ژنوتیپ های پلی مورفیسم G894T. 83

نمودار۳-۴-نمودار میانگین مقدار NO در هریک ازژنوتیپ های پلی مورفیسم T786C. 84

نمودار ۳-۵-میانگین مقدار NO در افراد دارای موتانت از هر دو نوع پلی مورفیسم (کد۳), افراد دارای یک نوع موتانت(کد۲)  و فاقد موتانت (کد ۱) ۸۶

فهرست شکل‌ها

شکل ۱-۱ بیوسنتز نیتریک اکسید. ۴

شکل (۱-۲) چگونه متابولیسم NO  متناسب با متابولیسم نیتروژن در بدن است.. ۵

شکل (۱-۳) ساختار ایزو فرم‌های مختلف NOs و چگونگی فعال شدن آنها ۸

شکل (۱-۴) کارکرد های فیزیولوزیکی هر یک از ایزوفرم ها ۱۰

شکل (۱-۵) چگونه استروژن باعث افزایش ترشح NO می‌شود. ۱۲

شکل (۱-۶) ۱۴

شکل (۱-۷): نقشNO مشتق شده از اندوتلیوم در تنظیم فشارخون و فعال‌سازیپلاکت‌ها ۱۷

شکل (۱-۸): ساختاراولیه‌ی پروتئین گوانیلات سیکلاز محلول و فعال شدن آن به شکل GMP حلقوی توسط NO.آنزیم یک هترودیمر با یک جزء همی است که برای اتصال NO و فعال شدن آنزیم ضروری است. ۱۷

شکل (۱-۹): تنظیم غلظت GMP حلقوی توسط گوانیلیل سیکلاز محلول وفسفودی استراز (PDE)V. 19

شکل (۱-۱۰): مکانیسمی که NO توسط آن انقباضاتسلول‌هایعضله‌ی صاف را کاهش می‌دهد.GMP. 22

شکل (۱-۱۱): مکانیسم مهار فعال شدن پلاکت‌هاتوسط NO. 25

شکل (۱-۱۲): برهمکنش‌های اکسید نیتریک با دیگر تنظیم‌کننده‌های عروقی که از اندوتلیوم یا پلاکت‌ها ترشح می‌شوند. انواعپیام‌رسان‌های اصلی داخل سلولی نشان داده‌شده‌اند. ۲۷

شکل ۳-۱- تصویر ژل الکتروفورز جهت تائیدDNAاستخراج‌شده. ۷۶

شکل ۳-۲-نتیجه الکتروفورز چند نمونه PCR شده از پلی مورفیسم G894T  که  در باند ۲۵۰ قرار گرفته اند. ۷۷

شکل ۳-۳-نتیجه الکتروفورز حاصل از PCR چند نمونه برای پلی مورفیسم T786C ومشاهده شده باند ۱۸۰ روی ژل الکتروفورز ۷۸

شکل ۳-۴-بعد از هضم آنزیمی محصولات PCR پلی مورفیسم G894T توسط آنزیم Ban II قطعات ۱۶۳ و۸۵ در حالتی که فاقد موتانت است مشاهده شد و در حالتی که دارای موتانت بود فاقد برش بود یعنی همان ۲۵۰ مشاهده شد. ودر صورتی که  هتروزیگوت بود برش های ۱۶۳ و۸۵و۲۵۰ هر سه مشاهده شد. ۷۹

شکل ۳-۵- پس از هضم آنزیمی  محصولات PCR  پلی مورفیسم T786C توسط آنزیم MspI  در صورت داشتن موتانت هضم شده وباندهای ۹۰و۴۰ و۵۰ ایجاد می‌شود ودر صورت داشتن آلل وحشی ۱۴۰و۴۰ ایجاد شده و در صورت هتروزیگوت بودن باند های ۱۴۰،۵۰ و۹۰ ایجاد می‌شود. ۸۰

نقد و بررسی‌ها

هیچ دیدگاهی برای این محصول نوشته نشده است.

اولین کسی باشید که دیدگاهی می نویسد “بررسی پلی مورفیسم¬های T-786C و G894T در ژن آنزیم نیتریک اکسید سنتتاز اندوتلیالی (eNOS) و بررسی ارتباط آنان با سطح نیتریک اکسید سرمی در افراد سالم غیر خویشاوند استان لرستان”
قبلا حساب کاربری ایجاد کرده اید؟
گذرواژه خود را فراموش کرده اید؟
Loading...