بررسی تأثیر غلظت‏های مختلف اکسیژن بر رشد و تکثیر سلول‏های بنیادی ‏پرتوان انسانی در شرایط کشت معلق درون بیوراکتور

تعداد    103   صفحه در فایل   word

ورود موفق فن‏آوری سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی و محصولات سلولی، به بخش‏های بالینی و صنعتی نیازمند غلبه بر مسائلی نظیر بهینه سازی و استاندارد سازی روش کشت و در پی آن تولید انبوه این سلول‏ها با کیفیت بالاست.

حفظ و تجدید حیات هر سلول به تأمین مواد مغذی و عوامل زیستی اثر گذار بر رشد و تکثیرِ سلول‏ها، وابسته است. در بین عوامل زیستی تأثیر گذار بر سیستم کشت سلول، عامل اکسیژن به‏دلیل شرکت در مسیرهای متابولیسمی و تأثیر مستقیم و غیر مستقیم بر ساختار و فرآیند‏های سلولی مورد توجه قرار گرفت و به جستجوی غلظتی از اکسیژن محلول در محیط کشت پرداخته شد که بهترین اثر را بر حفظ بنیادینگی سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی و افزایش راندمان تمایز آن‏ها دارد.

در آزمایش قبلیِ انجام شده در پژوهشگاه رویان، مشخص شد محیط کشت DMEM/F12-Glutamax غنی‏شده روی سلول‏های فیبروبلاست انسانی، بیشترین تأثیر را بر رشد، تکثیر و حفظ پرتوانی سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی، نسبت به سایر محیط‏های کشت‏ دارد. در مطالعه‏ی حاضر، اهمیت غلظت کمِ اکسیژن محلول در محیط کشت، از جهت حفظ پرتوانی سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی و ایجاد شرایطی برای افزایش راندمان تمایز این سلول‏ها، به انواعی از سلول‏های سه لایه زاینده جنینی، مشخص گردید؛ به‏طوری‏که، مقدار سی درصد اکسیژن هوای اشباع، شرایط اکسیژن کم را برای سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی فراهم می‏نماید.

کشت سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی در شرایط اکسیژن کم، علاوه‏بر افزایش بیان ژن‏های مسئولِ پرتوانی نظیر OCT4 و NANOG، بیان ژن‏های معرفِ حالت نائیو، نظیر STELLA و TBX3 را نیز در این سلول‏ها افزایش می‏دهد.

ازسوی‏دیگر بیشترین تمایل تمایزیِ سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی، به‏سمت سلول‏های لایه اکتودرمی است که با برداشته شدن شرایطِ حفظ پرتوانی، بروز می‏نماید. بیان ژن‏های معرف مراحل اولیه‏ی تمایز به سلول‏های اکتودرمی نظیر SOX1، PAX6 و NESTIN مشخص کرد، محیط کشت با اکسیژن کم، ممانعت از تمایز را بهتر اعمال می‏نماید.

فهرست عنوان‏ها

مقدمه                                                                                                                           ۱

فصل اول: کلیات تحقیق

  • تعریف سلول‌های بنیادی                                                ۳

  • انواع سلول‌های بنیادی بر اساس توان تمایزی ۳

  • سلول‌های بنیادی بزرگ‏سالان                                                             ۴

  • سلول‏های بنیادی پرتوان ۵

  • اهمیت سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                                      ۷

  • انواع روش‏های کشت سلول‏های بنیادی         ۸

  • کشت معلق                                                                                                        ۹

  • مزایای کشت معلقِ سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                     ۱۱

  • نگرانی‏های کشت معلقِ سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                    ۱۳

  • عوامل زیستی تأثیر گذار بر کشت معلقِ سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی     ۱۴

۱-۱۰-۱- مواد مغذی                                                                                                        ۱۴

۱-۱۰-۲- pH                                                                                                                ۱۴

۱-۱۰-۳- دما                                                                                                                 ۱۵

۱-۱۰-۴- رطوبت                                                                                                            ۱۵

۱-۱۰-۵- تنش برشی                                                                                                       ۱۵

۱-۱۰-۶- تراکم سولی                                                                                                      ۱۵

۱-۱۰-۷- اکسیژن                                                                                                            ۱۶

فصل دوم: مبانی نظری و پیشینه‏ی تحقیق

۲-۱- کشت معلق سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                                     ۲۱

۲-۲- تأثیر اکسیژن بر سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                                 ۲۱

فصل سوم: روش‌ تحقیق

۳-۱- تجهیزات، مواد و لوازم مورد استفاده                                                                              ۲۵

۳-۲- آماده‏سازی مواد                                                                                                       ۲۸

۳-۲-۱- بتامرکاپتواتانول                                                                                                    ۲۸

۳-۲-۲- فاکتور رشد فیبروبلاستی بازی                                                                                  ۲۹

۳-۲-۳- مهارکننده‏ی راک                                                                                                  ۲۹

۳-۲-۴- مایتومایسین- سی                                                                                                 ۲۹

۳-۲-۵- آنزیم کلاژناز نوع چهار                                                                                          ۳۰

۳-۲-۶- ماتریکس خارج سلولی (ماتریژل)                                                                              ۳۰

۳-۲-۷- محیط انجماد سلول‏های بنیادی پرتوان                                                                         ۳۱

۳-۳- روش کار                                                                                                              ۳۱

۳-۳-۱- غنی‏سازی محیط کشت سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                    ۳۱

۳-۳-۲- تولید سلول‏های فیبروبلاستی جنین موش                                                                     ۳۱

۳-۳-۳- تهیه فیبروبلاست از پوست‌ ختنه‌‏گاه نوزاد انسان                                                             ۳۴

۳-۳-۴- پاساژ سلول‌های فیبروبلاستی (موشی و انسانی)                                                          ۳۵

۳-۳-۵- انجماد سلول‌های فیبروبلاستی                                                                                  ۳۶

۳-۳-۶- ذوب سلول‌های فیبروبلاستی                                                                                   ۳۷

۳-۳-۷- آماده‌سازی سلول‌های فیبروبلاستی به‌عنوان لایه‏ی تغذیه رسان                                            ۳۷‌

۳-۳-۸- توقف تقسیم سلول‌های فیبروبلاستی (روش شیمیایی)                                                     ۳۸

۳-۳-۹- سلول‏های بنیادی پرتوان انسانیِ مورد استفاده در مطالعه حاضر                                           ۳۸

۳-۳-۱۰- محیط کشت سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                              ۳۸

۳-۳-۱۱- رتبه‏بندی کلونی‏هایِ سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                     ۳۹

۳-۳-۱۲- کشت سلول‌های بنیادی پرتوان انسانی روی ماتریکس خارج سلولی                                   ۴۰

۳-۳-۱۳- کشت سوسپاسیون سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                       ۴۱

۳-۳-۱۳-۱ بدست آوردن سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی منفرد                                                    ۴۱

۳-۳-۱۳-۲- تشکیل تجمع‏های سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                     ۴۴

۳-۳-۱۳-۳- نگهداری تجمع‏های سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                  ۴۴

۳-۳-۱۳-۴- پاساژ تجمع‏های سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                       ۴۵

۳-۳-۱۴- انجماد سلول‌های بنیادی پرتوان انسانی                                                                      ۴۶

۳-۳-۱۵- ذوب کردن سلول‌های بنیادی پرتوان انسانی                                                                ۴۷

۳-۳-۱۶- تمایز خودبه‏خودی سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                       ۴۸

۳-۳-۱۷- تعیین قطر تجمع‏های سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                     ۴۹

۳-۳-۱۸- انجام واکنش Real-time RT-PCR                                                                     ۴۹

۳-۳-۱۸-۱- استخراج RNA از سلول­های بنیادی پرتوان انسانی                                                    ۴۹

۳-۳-۱۸-۲- مراحل استخراج RNA                                                                                     ۵۰

۳-۳-۱۸-۳- بررسی کمی RNA استخراج ­شده                                                                        ۵۱

۳-۳-۱۸-۴- بررسی کیفی RNA استخراج ­شده                                                                        ۵۲

۳-۳-۱۸-۵- روش تهیه ژل آگارز و انجام الکتروفورز                                                                 ۵۲

۳-۳-۱۸- ۶- طرز تهیه محلول‏های الکتروفورز                                                                         ۵۲

۳-۳-۱۸- ۷- سنتز cDNA                                                                                                 ۵۳

۳-۳-۱۸- ۸- طراحی پرایمر                                                                                               ۵۵

۳-۳-۱۸-۹- ارزیابی اختصاصی بودن پرایمرها                                                                         ۵۶

۳-۳-۱۸-۱۰- ارزیابی کارایی پرایمرها                                                                                   ۵۶

۳-۳-۱۸- ۱۱ تعریف Real time PCR                                                                                                ۵۷

۳-۳-۱۸- ۱۲ ارزیابی کمّی بیان ژن­ها                                                                                    ۵۸

۳-۳-۱۸- ۱۳- آنالیز داده­ها                                                                                                ۶۰

۳-۳-۱۹- روش سنجش اکسیژن محیط کشت                                                                          ۶۰

فصل چهارم: یافته‏های تحقیق

۴-۱- کشت سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی در دو شرایط، با غلظت کم و طبیعیِ اکسیژن                     ۶۴

۴-۱-۱- تأثیر غلظت کم اکسیژن، بر بیان ژن فاکتور القاﺀ کننده‏ی هیپوکسی۱-آلفا                               ۶۴

۴-۱-۲- تأثیر غلظت کم اکسیژن، بر بیان ژن‏های پرتوانی در سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                 ۶۵

۴-۱-۳- بیان ژ‏ن‏های مؤثر در عبور گلوکز از غشاﺀ به داخل سلول و مؤثر در مسیر گلیکولیز                 ۶۶

۴-۱-۴- بیان ژن‏های مراحل اولیه تمایز در سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                     ۶۷

۴-۲- تأثیر اکسیژن بر بیان ژن‏های تمایزی در سلول‏های بنیادی پرتوان انسانیِ تمایز یافته                     ۶۸

۴-۲-۱ تأثیر اکسیژن کم بر تمایز سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی و بیان ژن‏های اکتودرمی                    ۶۸

۴-۲-۲- تأثیر اکسیژن کم بر تمایز سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی و بیان ژن‏های مزودرمی                  ۶۹

۴-۲-۳-  تأثیر اکسیژن کم بر تمایز سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی و بیان ژن‏های اندودرمی                ۷۰

۴-۳- تأثیر غلظت کم اکسیژنِ، بر بیان ژن‏های دخیل در تقسیم سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی             ۷۱

فصل پنجم: جمعبندی، نتیجه گیری و ارائه پیشنهادات

۵-۱- جمعبندی و نتیجه گیری                                                                                      ۷۸

۵-۲- پیشنهادات                                                                                                      ۸۱

منابع                                                                                                     ۸۲

چکیده‏ی انگلیسی                                                                                     ۸۷

فهرست جدول‏ها

جدول۳-۱- لیست تجهیزات                                                                                               ۲۵

جدول۳-۲- لیست مواد                                                                                                     ۲۶

جدول ۳-۳- لیست لوازم مصرفی                                                                                         ۲۷

جدول ۳-۴- مشخصات کیت­های مصرفی                                                                               ۲۸

جدول۳-۵- ترکیبات محیط کشت سلول‌های فیبروبلاستی برای هزار میلی‌لیتر                                     ۳۲

جدول۳-۶- ترکیبات محلول انجماد سلول‌های فیبروبلاستی                                                          ۳۷

جدول۳-۷- رتبه‏بندی کلونی‏ سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                        ۴۰

جدول۳-۸- ارزیابی کمی RNA با دستگاه اسپکتروفوتومتر                                                           ۵۱

جدول۳-۹- مواد مورد نیاز برای سنتز cDNA                                                                                       ۵۴

جدول۳-۱۰- برنامه دمایی سنتز cDNA                                                                                               ۵۴

جدول۳-۱۱- مشخصات پرایمرهای مورد استفاده                                                                      ۵۵

جدول۳-۱۲- مواد لازم برای انجام Real-time RT-PCR                                                                      ۵۹

جدول۳-۱۳- برنامه دمایی Real-time RT-PCR                                                                                  ۵۹

فهرست شکل‏ها

شکل۱-۱- سیستم فلاسک همزن                                                                                          ۱۰

شکل۱-۲- دستگاه بیوراکتور با سیستم همزن مرکزی                                                                  ۱۴

شکل۱-۳- مسیر و آنزیم‏های متابولیسمی                                                                                ۱۷

شکل۱-۴- تأثیر اکسیژن بر فاکتور رونویسیِ القاﺀ کننده‏ی هیپوکسی                                                 ۱۹

شکل۳-۱- مراحل تهیه سلول‏های فیبروبلاستی جنین موش                                                           ۳۳

شکل۳-۲- وضعیت کشت سلول‌های فیبروبلاستی                                                                     ۳۶

شکل۳-۳- رتبه‏بندی کلونیِ سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                          ۳۹

شکل۳-۴- ریخت ظاهری سلول‏ها، کلونی سلولی و قسمت‏های تمایز یافته                                        ۴۳

شکل۳- ۵- پاساژ سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                                      ۴۵

شکل۳-۶-  تعیین کارایی پرایمر از طریق رقیق ­سازی سریالی                                                        ۵۷

شکل۳-۷- سیستم تنظیم و کنترل اکسیژن محلول در محیط کشت                                                   ۶۲

شکل۴-۱- تصویر تجمع‏هایِ سه رده‏ی سلولی در روز هفتم کشت                                                 ۷۳

شکل۴-۲-  کشت دو بعدی سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی در شرایط اکسیژن کم و طبیعی                   ۷۵

فهرست نمودارها

نمودار۳-۱- تکثیر کارایی پرایمر Gapdh                                                                                             ۵۷

نمودار۳-۲- منحنی استاندارد کارایی پرایمر Gapdh                                                                               ۵۸

نمودار۳-۳- تنظیم میزان اکسیژن محلول در محیط کشت                                                              ۶۱

نمودار۴-۱- بیان ژن فاکتور القاﺀ کننده‏ی ‏هیپوکسی۱- آلفا                                                            ۶۵

نمودار۴-۲- بیان ژن‏های معرف پرتوانی در سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                        ۶۶

نمودار۴-۳-  بیان ژن‏های مؤثر در انتقال گلوکز از غشاﺀ سلول و اولین آنزیم‏ مسیر گلیکولیز                    ۶۷

نمودار ۴-۴-  بیان ژن‏های مراحل اولیه تمایز به سلول‏های اکتودرمی                                                ۶۸

نمودار۴- ۵-  بیان ژن‏های لایه زاینده اکتودرمی در سلول‏های بنیادی پرتوان انسانیِ تمایز یافته                 ۶۹

نمودار۴-۶- بیان ژن‏های لایه‏ی زاینده‏ی مزودرمی، در سلول‏های بنیادی پرتوان انسانیِ تمایز یافته            ۷۰

نمودار۴-۷- بیان ژن‏های لایه زاینده اِندودرمی در سلول‏های بنیادی پرتوان انسانیِ تمایز یافته                  ۷۱

نمودار۴-۸- بیان ژن‏های مؤثر بر تکثیر سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                            ۷۲

نمودار۴-۹- تکثیر سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی در شرایط کشت با اکسیژن کم و طبیعی                    ۷۴

نمودار۴-۱۰-  میزان تکثیر سلولی در روش کشت دو بعدی، با شرایط اکسیژن کم و طبیعی                    ۷۶

نقد و بررسی‌ها

هیچ دیدگاهی برای این محصول نوشته نشده است.

اولین کسی باشید که دیدگاهی می نویسد “بررسی تأثیر غلظت‏های مختلف اکسیژن بر رشد و تکثیر سلول‏های بنیادی ‏پرتوان انسانی در شرایط کشت معلق درون بیوراکتور”
قبلا حساب کاربری ایجاد کرده اید؟
گذرواژه خود را فراموش کرده اید؟
Loading...