بررسی تأثیر غلظت‏های مختلف اکسیژن بر رشد و تکثیر سلول‏های بنیادی ‏پرتوان انسانی در شرایط کشت معلق درون بیوراکتور

فهرست عنوان‏ها

مقدمه                                                                                                                           1

فصل اول: کلیات تحقیق

• تعریف سلول‌های بنیادی                                                3

• انواع سلول‌های بنیادی بر اساس توان تمایزی 3

• سلول‌های بنیادی بزرگ‏سالان                                                             4

• سلول‏های بنیادی پرتوان 5

• اهمیت سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                                      7

• انواع روش‏های کشت سلول‏های بنیادی         8

• کشت معلق                                                                                                        9

• مزایای کشت معلقِ سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                     11

• نگرانی‏های کشت معلقِ سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                    13

• عوامل زیستی تأثیر گذار بر کشت معلقِ سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی     14

1-10-1- مواد مغذی                                                                                                        14

1-10-2- pH                                                                                                                14

1-10-3- دما                                                                                                                 15

1-10-4- رطوبت                                                                                                            15

1-10-5- تنش برشی                                                                                                       15

1-10-6- تراکم سولی                                                                                                      15

1-10-7- اکسیژن                                                                                                            16

فصل دوم: مبانی نظری و پیشینه‏ی تحقیق

2-1- کشت معلق سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                                     21

2-2- تأثیر اکسیژن بر سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                                 21

فصل سوم: روش‌ تحقیق

3-1- تجهیزات، مواد و لوازم مورد استفاده                                                                              25

3-2- آماده‏سازی مواد                                                                                                       28

3-2-1- بتامرکاپتواتانول                                                                                                    28

3-2-2- فاکتور رشد فیبروبلاستی بازی                                                                                  29

3-2-3- مهارکننده‏ی راک                                                                                                  29

3-2-4- مایتومایسین- سی                                                                                                 29

3-2-5- آنزیم کلاژناز نوع چهار                                                                                          30

3-2-6- ماتریکس خارج سلولی (ماتریژل)                                                                              30

3-2-7- محیط انجماد سلول‏های بنیادی پرتوان                                                                         31

3-3- روش کار                                                                                                              31

3-3-1- غنی‏سازی محیط کشت سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                    31

3-3-2- تولید سلول‏های فیبروبلاستی جنین موش                                                                     31

3-3-3- تهیه فیبروبلاست از پوست‌ ختنه‌‏گاه نوزاد انسان                                                             34

3-3-4- پاساژ سلول‌های فیبروبلاستی (موشی و انسانی)                                                          35

3-3-5- انجماد سلول‌های فیبروبلاستی                                                                                  36

3-3-6- ذوب سلول‌های فیبروبلاستی                                                                                   37

3-3-7- آماده‌سازی سلول‌های فیبروبلاستی به‌عنوان لایه‏ی تغذیه رسان                                            37‌

3-3-8- توقف تقسیم سلول‌های فیبروبلاستی (روش شیمیایی)                                                     38

3-3-9- سلول‏های بنیادی پرتوان انسانیِ مورد استفاده در مطالعه حاضر                                           38

3-3-10- محیط کشت سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                              38

3-3-11- رتبه‏بندی کلونی‏هایِ سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                     39

3-3-12- کشت سلول‌های بنیادی پرتوان انسانی روی ماتریکس خارج سلولی                                   40

3-3-13- کشت سوسپاسیون سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                       41

3-3-13-1 بدست آوردن سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی منفرد                                                    41

3-3-13-2- تشکیل تجمع‏های سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                     44

3-3-13-3- نگهداری تجمع‏های سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                  44

3-3-13-4- پاساژ تجمع‏های سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                       45

3-3-14- انجماد سلول‌های بنیادی پرتوان انسانی                                                                      46

3-3-15- ذوب کردن سلول‌های بنیادی پرتوان انسانی                                                                47

3-3-16- تمایز خودبه‏خودی سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                       48

3-3-17- تعیین قطر تجمع‏های سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                     49

3-3-18- انجام واکنش Real-time RT-PCR                                                                     49

3-3-18-1- استخراج RNA از سلول­های بنیادی پرتوان انسانی                                                    49

3-3-18-2- مراحل استخراج RNA                                                                                     50

3-3-18-3- بررسی کمی RNA استخراج ­شده                                                                        51

3-3-18-4- بررسی کیفی RNA استخراج ­شده                                                                        52

3-3-18-5- روش تهیه ژل آگارز و انجام الکتروفورز                                                                 52

3-3-18- 6- طرز تهیه محلول‏های الکتروفورز                                                                         52

3-3-18- 7- سنتز cDNA                                                                                                 53

3-3-18- 8- طراحی پرایمر                                                                                               55

3-3-18-9- ارزیابی اختصاصی بودن پرایمرها                                                                         56

3-3-18-10- ارزیابی کارایی پرایمرها                                                                                   56

3-3-18- 11 تعریف Real time PCR                                                                                                57

3-3-18- 12 ارزیابی کمّی بیان ژن­ها                                                                                    58

3-3-18- 13- آنالیز داده­ها                                                                                                60

3-3-19- روش سنجش اکسیژن محیط کشت                                                                          60

فصل چهارم: یافته‏های تحقیق

4-1- کشت سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی در دو شرایط، با غلظت کم و طبیعیِ اکسیژن                     64

4-1-1- تأثیر غلظت کم اکسیژن، بر بیان ژن فاکتور القاﺀ کننده‏ی هیپوکسی1-آلفا                               64

4-1-2- تأثیر غلظت کم اکسیژن، بر بیان ژن‏های پرتوانی در سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                 65

4-1-3- بیان ژ‏ن‏های مؤثر در عبور گلوکز از غشاﺀ به داخل سلول و مؤثر در مسیر گلیکولیز                 66

4-1-4- بیان ژن‏های مراحل اولیه تمایز در سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                     67

4-2- تأثیر اکسیژن بر بیان ژن‏های تمایزی در سلول‏های بنیادی پرتوان انسانیِ تمایز یافته                     68

4-2-1 تأثیر اکسیژن کم بر تمایز سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی و بیان ژن‏های اکتودرمی                    68

4-2-2- تأثیر اکسیژن کم بر تمایز سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی و بیان ژن‏های مزودرمی                  69

4-2-3-  تأثیر اکسیژن کم بر تمایز سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی و بیان ژن‏های اندودرمی                70

4-3- تأثیر غلظت کم اکسیژنِ، بر بیان ژن‏های دخیل در تقسیم سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی             71

فصل پنجم: جمعبندی، نتیجه گیری و ارائه پیشنهادات

5-1- جمعبندی و نتیجه گیری                                                                                      78

5-2- پیشنهادات                                                                                                      81

منابع                                                                                                     82

چکیده‏ی انگلیسی                                                                                     87

فهرست جدول‏ها

جدول3-1- لیست تجهیزات                                                                                               25

جدول3-2- لیست مواد                                                                                                     26

جدول 3-3- لیست لوازم مصرفی                                                                                         27

جدول 3-4- مشخصات کیت­های مصرفی                                                                               28

جدول3-5- ترکیبات محیط کشت سلول‌های فیبروبلاستی برای هزار میلی‌لیتر                                     32

جدول3-6- ترکیبات محلول انجماد سلول‌های فیبروبلاستی                                                          37

جدول3-7- رتبه‏بندی کلونی‏ سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                        40

جدول3-8- ارزیابی کمی RNA با دستگاه اسپکتروفوتومتر                                                           51

جدول3-9- مواد مورد نیاز برای سنتز cDNA                                                                                       54

جدول3-10- برنامه دمایی سنتز cDNA                                                                                               54

جدول3-11- مشخصات پرایمرهای مورد استفاده                                                                      55

جدول3-12- مواد لازم برای انجام Real-time RT-PCR                                                                      59

جدول3-13- برنامه دمایی Real-time RT-PCR                                                                                  59

فهرست شکل‏ها

شکل1-1- سیستم فلاسک همزن                                                                                          10

شکل1-2- دستگاه بیوراکتور با سیستم همزن مرکزی                                                                  14

شکل1-3- مسیر و آنزیم‏های متابولیسمی                                                                                17

شکل1-4- تأثیر اکسیژن بر فاکتور رونویسیِ القاﺀ کننده‏ی هیپوکسی                                                 19

شکل3-1- مراحل تهیه سلول‏های فیبروبلاستی جنین موش                                                           33

شکل3-2- وضعیت کشت سلول‌های فیبروبلاستی                                                                     36

شکل3-3- رتبه‏بندی کلونیِ سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                          39

شکل3-4- ریخت ظاهری سلول‏ها، کلونی سلولی و قسمت‏های تمایز یافته                                        43

شکل3- 5- پاساژ سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                                                      45

شکل3-6-  تعیین کارایی پرایمر از طریق رقیق ­سازی سریالی                                                        57

شکل3-7- سیستم تنظیم و کنترل اکسیژن محلول در محیط کشت                                                   62

شکل4-1- تصویر تجمع‏هایِ سه رده‏ی سلولی در روز هفتم کشت                                                 73

شکل4-2-  کشت دو بعدی سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی در شرایط اکسیژن کم و طبیعی                   75

فهرست نمودارها

نمودار3-1- تکثیر کارایی پرایمر Gapdh                                                                                             57

نمودار3-2- منحنی استاندارد کارایی پرایمر Gapdh                                                                               58

نمودار3-3- تنظیم میزان اکسیژن محلول در محیط کشت                                                              61

نمودار4-1- بیان ژن فاکتور القاﺀ کننده‏ی ‏هیپوکسی1- آلفا                                                            65

نمودار4-2- بیان ژن‏های معرف پرتوانی در سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                        66

نمودار4-3-  بیان ژن‏های مؤثر در انتقال گلوکز از غشاﺀ سلول و اولین آنزیم‏ مسیر گلیکولیز                    67

نمودار 4-4-  بیان ژن‏های مراحل اولیه تمایز به سلول‏های اکتودرمی                                                68

نمودار4- 5-  بیان ژن‏های لایه زاینده اکتودرمی در سلول‏های بنیادی پرتوان انسانیِ تمایز یافته                 69

نمودار4-6- بیان ژن‏های لایه‏ی زاینده‏ی مزودرمی، در سلول‏های بنیادی پرتوان انسانیِ تمایز یافته            70

نمودار4-7- بیان ژن‏های لایه زاینده اِندودرمی در سلول‏های بنیادی پرتوان انسانیِ تمایز یافته                  71

نمودار4-8- بیان ژن‏های مؤثر بر تکثیر سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی                                            72

نمودار4-9- تکثیر سلول‏های بنیادی پرتوان انسانی در شرایط کشت با اکسیژن کم و طبیعی                    74

نمودار4-10-  میزان تکثیر سلولی در روش کشت دو بعدی، با شرایط اکسیژن کم و طبیعی                    76