فهرست
چکیده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….9
فصل اول – اهمیت لیپیدها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..10
1-2آنزیم لیپاز : ………………………………. …………………………………………………………………………………………………………………………………………………..11
1-2-1 نحوه ی عمل لیپاز : ………………………. ……………………………………………………………………………………………………………………………………………11
1- 2-2 ویژگی آنزیم لیپاز : ……………… …………………………………………………………………………………………………………………………………………………..12
1-2-2-1 بیوکاتالیست : …………….. …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………12
1-2-2 -2کاتالیزور واکنش های هیدرولیتیکی ………….. ……………………………………………………………………………………………………………………………..12
1-2-2-3 هیدرولیز پیوندهای استری بین آسیل و گلیسرول و هیدرولیز استرها…………………………………………………………………………………………………12
1-2-2-4 ترانس استریفیکاسیون………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..13
1-2 -3 مزایای استفاده از لیپازها…………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………….13
1-3 کاربردهای لیپازها در صنعت …………………………. ………………………………………………………………………………………………………………………………14
1-4 لیپازهای باکتریایی و قارچی…………………………….. ……………………………………………………………………………………………………………………………..16
1-5 مزایای استفاده از لیپازها به جای کاتالیزور شیمیایی …………………. ………………………………………………………………………………………………………17
1-6 فسفولیپاز. …………………………….. ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………17
1-6-1 عملکرد فسفولیپاز………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..17
1-6-2 انواع فسفولیپاز………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………….17
1-7 مزیت لیپازهای میکروبی…………………………. ……………………………………………………………………………………………………………………………………..18
1-7-1 میکروارگانیسم های مولد……………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………..18
1-7-2 قارچ ها و عوامل موثر بر تولید. ………………………………….. ……………………………………………………………………………………………………………..18
1-7-3 pH بهینه فعالیت و مقاومت حرارتی …………………………… …………………………………………………………………………………………………………….19
1-8 روش خالص سازی آنزیم های لیپاز و فسفولیپاز . …………………….. ………………………………………………………………………………………………………..20
1-8-1توصيف كروماتوگرافي ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….21
فصل دوم
2-1 آنزیم لیپاز و فسفولیپاز و مکانیسم تاثیر روی لیپید : ……………………………………………………………………………………………………………………………..22
2-2 کاربردهای آنزیم لیپاز ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………22
2-2-1 در صنعت : ……………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..22
2-2-2 در پزشکی…………………………………….. ……………………………………………………………………………………………………………………………………………25
2-2-3 در محیط زیست………………………….. ………………………………………………………………………………………………………………………………………………27
2-3 کاربردهای آنزیم فسفولیپاز………………. ………………………………………………………………………………………………………………………………………………29
2-4 روشهای جداسازی لیپاز…………………….. ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..30
2-4-1 از خاک……………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..30
2-4-2 از اجزای داخل بدن موجودات عالی………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………31
2-4-3 میکروارگانیسم های مولد آنزیم لیپاز قارچی……………………… ……………………………………………………………………………………………………………..33
2-4-4 میکروارگانیسم های مولد آنزیم لیپاز باکتریایی…………………………… ……………………………………………………………………………………………………35
2-5 خالص سازی آنزیم لیپاز و بررسی فعالیت آنزیم لیپاز………………………………………………………………………………………………………………………………37
2-5-1 بهینه سازی تولید آنزیم لیپاز باکتریایی……………………………………………………………………………………………………………………………………………..39
2-5-2 بهینه سازی تولید آنزیم لیپاز قارچی………………………………………………………………………………………………………………………………………………….39
فصل سوم
3-1-نمونه برداری…………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………………………..42
3-2 جداسازی قارچ ها از خاک………………………. ……………………………………………………………………………………………………………………………………..42
3-3 خاص سازی و نگهداری جدایه های قارچی………………. ……………………………………………………………………………………………………………………..42
3-4 شناسایی اولیه بر اساس مرفولوژی …………………………………….. …………………………………………………………………………………………………………….43
3-4-1 شناسایی قارچ ها به روش اسلاید کالچر…………………………… …………………………………………………………………………………………………………..43
3-4-2 مواد لازم برای اسلاید کالچر …………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………43
3-5 جداسازی قارچ های دارای آنزیم لیپاز………………………………. ……………………………………………………………………………………………………………….44
3-6 جداسازی قارچهای مولد آنزیم فسفولیپاز…………………… ………………………………………………………………………………………………………………………46
3-7 شناسایی ملکولی قارچهای مولد آنزیم لیپاز و فسفولیپاز………………………………………………………………………………………………………………………..46
3-7-1 استخراج DNA به روش فنل کلروفرم……………………………………………………………………………………………………………………………………………46
3 – 7 -2 تعیین کیفیت DNA با استفاده از الکتروفورز بر روی ژل آگاروز………………………………………………………………………………………………….47
3 – 7-3. واکنشPCR (Polymerase Chain Reaction) …………………………………………………………………………………………………………………..47
3 – 8 الكتروفورز روی ژل آگارز…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….50
3 – 8- 1 . مواد مورد استفاده به شرح زير است ………………………………………………………………………………………………………………………………………..50
3-9 بررسی آنزیم به روش اسپکتوفتومتری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………52
3-10 بهینه سازی شرایط تولید آنزیم لیپاز برای قارچ پنی سلیوم کرایزوژنوم سویه ی KC884440.1……………………………………………………………53
فصل چهارم
4-1 مختصات نقاط نمونه برداری ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….55
4-2 فرمول محیط کشت های YGC و PDA……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 57
4-2-1 فرمول محیط کشت YGC…………… …………………………………………………………………………………………………………………………………………………58
4-2-2فرمول محیط کشت PDA………………….. …………………………………………………………………………………………………………………………………………58
4-3 تلقیح قارچ ها به محیط های کشت….. …………………………………………………………………………………………………………………………………………………..59
4-4 خالص سازی قارچ ها……………… …………………………………………………………………………………………………………………………………………………….60
4-5 فراوانی قارچ ها………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………60
4-6 جداسازی قارچهای دارای آنزیم لیپاز…………….. ……………………………………………………………………………………………………………………………………..61
4-7 شناسایی قارچ های مولد آنزیم فسفولیپاز…………… ………………………………………………………………………………………………………………………………….62
4-8 شناسایی میکروسکوپی قارچ های غالب مولد آنزیم………………………………………………………………………………………………………………………………….63
4-9 شناسایی مولکولی قارچ های غالب مولد آنزیم………………………………………………………………………………………………………………………………………….64
4-9-1 انجام PCR . ……………………….. ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..64
4-9-2 نتایج حاصل از توالی یابی ژنومی…………. ……………………………………………………………………………………………………………………………………………65
4-9-3 نتایج بلاست نمونه ها………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………65
4-10 نتایج حاصل از اسپکتوفتومتری……………….. …………………………………………………………………………………………………………………………………………..71
4-11 نتایج حاصل از بهینه سازی دما و pH………………………………………………………………………………………………………………………………………………………72
فصل پنجم
5-1 نتیجه گیری …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….74
5-2 پیشنهادات …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………77
چکیده انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..79
رفرنس ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..80
فهرست جدول ها
جدول3 – 1پرایمرهای استفاده شده در PCRبه روشEC18…………………………………………………………………….48
جدول 3-2 دستورالعمل انجام واکنشPCRتاحجم 25 میکرولیتر…………………………………………………………………49
جدول شماره(3 – 3). برنامه تکثیرژن دردستگاه ترموسایکلر……………………………………………………………………..50
4-1 مختصات نقاط نمونه برداری ………………………………………………….. …………………………………………………….56
جدول 4-2 فراوانی قارچ ها در خاک ناهارخوران گرگان…………………………………………………………………………60
جدول 4-3 قارچهای دارای آنزیم لیپاز و میزان تولید بر اساس دانسیته ی نوری……………………………………………..71
جدول 4-4 میزان جذب آنزیم فسفولیپاز………………………………………………………………………………………………….71
جدول 4-5 نتایج شناسایی ملکولی در سطح جنس و گونه……………………………………………………………………………72
جدول4-6 کلیدهای شناسایی قارچ ها………………………………………………………………………………………………………72
فهرست شکل ها
تصویر 1-1 مکانیسم عمل آنزیم لیپاز………………………………………………………………………………………………………………..12
شکل 3-1 استفاده از فیلتر سرنگی برای حذف میکروارگانیسم ها………………………………………………………………………………….53
شکل 4-1 تلقیح اولیه به محیط عمومی YGC…………………………………………………………………………………………………………………59
شکل 4-2 محیط های تلقیح مساوی و تفاوت رشد در 2 محیط کشت…………………………………………………………………………..59
شکل 4-3 قارچ ها پس از خالص سازی………………………………………………………………………………………………………………………60
شکل 4-4 محیط کشت پایه ی تری بوتیرین آگار……………………………………………………………………………………………………….61
شکل4-5 روغن و محیط کشت تری بوتیرین آگار………………………………………………………………………………………………………62
شکل 4-6 بررسی هاله ی هیدرولیزی لیپاز…………………………………………………………………………………………………………………..62
شکل 4-7 استریل کردن تخم مرغ در اتانول 70 %………………………………………………………………………………………………………..63
شکل 4-8 بررسی قارچ های مولد آنزیم فسفولیپاز………………………………………………………………………………………………………..63
|
|
