%31تخفیف

کلونینگ و بیان ژن آلبومین سرم انسانی

تعداد 107صفحه در فایل word

کارشناسی ارشد رشته زیست شناسی گرایش سلولی و ملکولی (M.Sc)

کلونینگ و بیان ژن آلبومین سرم انسانی

چکيد ه :

‌ آلبومين عمده‌ترين پروتئين پلاسما می‌باشد، اين پروتئين نه تنها به عنوان حامل بسياری از ماکرومولکول‌ها در بدن نقش عمده‌ای را ايفا می‌کند بلکه نقش مهمی در تنظيم فشار اسمزی دارد .

امروزه از آلبومين در درمان خونريزی‌ها و سوختگی‌های شديد و هم‌چنين در درمان افراد مبتلا به کمبود آلبومين استفاده می‌شود. مصرف ساليانه آلبومين در دنيا حدود 450 تن می‌باشد.

به‌ منظور برطرف کردن اين نياز و توليد آلبومين عاری از هرگونه آلودگی از روش‌های بيوتکنولوژی استفاده شده است.

در اين تحقيق از سویه خاصی از باکتری اشرشیا کلی(BL21 ) که امروزه در سطح وسيعی به ‌منظور توليد پروتئين‌های هترولوگ به‌کار برده می‌شود،‌ به ‌عنوان ميزبان برای تولید آلبومين انسانی نوترکيب استفاده گرديده است ونتایج بدست آمده بیان کننده این مطلب هستند که با استفاده از این شرایط می توان آلبومین را در مقیاس صنعتی تولید نمود.

رده سلولی HepG2 در محیط کشت سلولی₁₆₄₀ RPMI کشت داده شدند ، جهت تحریک بیان ژن آلبومین انسانی، این سلول ها با ml 50 از هر دو داروی Simvastatin وAtorvastatin تیمار شدند، بعد از تخلیص RNA تام ،cDNA ساخته شد .

ژن آلبومین انسانی(bp 1842) از طریق واکنش زنجیره ای پلی مراز ( PCR ) تکثیر شد و محصول PCR با استفاده از ژل آگاروز 1درصد با رنگ آمیزی سایبرگرین ردیابی شد سپس ژن تکثیر شده در پلاسمیدBluescript کلون گردید .

محتوای واکنش pGE / Human Albumin (پلاسمید سنتز شده) به سلول پذیرای سویه Top10 باکتری اشرشیا کلی انتقال یافت.

پلاسمید نوترکیب استخراج شد و توسط آنزیم های محدود کننده XhoI و HindIII هضم گردید. ژن استخراج شده در وکتور بیانی pET22b ساب کلون شد.

وکتور مورد نظر به سلول پذیرای BL21 (DE3) ، انتقال یافت وکلونی های حاوی وکتور بیانی نوترکیب کشت شبانه داده شدند.

وقتی کدورت محیط کشت ها به OD₆₀₀= 0/6 رسید، توسطIPTG 1.5mM ( ایزوپروپیل بتا-دی-تیو گالاکتوزید ) القا شد ، سپس در ساعات مختلف رسوب گیری انجام شد و روی ژل SDS-PAGE %10 مورد ارزیابی قرار گرفت . تولید پروتئین آلبومین با روش وسترن بلات تائید گردید.

کلمات کلیدی : آلبومین انسانی،pET22b ، Simvastatin ،Atorvastatin

دسته: زیست شناسی, علوم تجربی برچسب: Atorvastatin, pET22b, Simvastatin, کلمات کلیدی : آلبومین انسانی

توضیحات
نظرات (4)

فهرست مطالب:

چکيد ه 11

فصل اول. 14

کلیات.. 14

1-1- مقدمه 15

1-2- آلبومین سرم انسانی. 16

1-3- مشخصات بیوشیمیایی آلبومین. 17

1-4- ساختار و شکل فضایی پروتئین آلبومین انسانی. 19

1-5- عملکرد پروتئین آلبومین انسانی. 20

1-6- آلبومین سرم انسانی. 21

1-7- ژن آلبومین انسانی. 21

1-8- پدیده Alternative ‌Splicing در ژن آلبومین انسانی وکوتاه شدن طول ژن آن در افراد مختلف 22

1-9- دلایل انتخاب موضوع. 23

1-11- سوال اصلی تحقیق. 24

1-12- بیوسنتز آلبومین انسانی. 24

1-13- تحریک سلول های HepG2 به منظور تولید آلبومین انسانی. 25

1-14- کاربرد اصلی استاتین ها 25

1-15- مکانیسم اثر استاتین ها 26

1-16- وکتور بیان pET-22b. 27

1-17- بیان HSAنوترکیب.. 29

1-18- تنظیم بیان ژن. 30

فصل دوم 32

پیشینه تحقیق. 32

فصل سوم 35

مواد وروش ها 35

3-1- طراحی تحقیق. 36

3-2 وسایل مورد استفاده 36

3-3 مواد مورد استفاده 37

3-4 مواد مورد استفاده 37

3-5- بافرها و محلول هاي مورد استفاده طی مراحل تحقیق. 40

3-5-1- محلول هاي لازم جهت استخراج RNA از HepG2 cell line 40

3-5-2- محيط كشت مايع LB (Luria- Bertani) 40

3-5-3- محيط كشت LB Agar 40

3-5-4- محلول هاي لازم جهت استخراج پلاسميد با روش لیز قلیایی( (Alkaline minipreparation. 41

3-5-5- محلول هاي لازم جهت الكتروفورز روي ژل آگارز 42

3-5-5-1- محلول TAE 1X.. 42

3-5-5-2- بافرلودينگ (Loading buffer) 43

3-5-5-3- Lysis buffer 43

3-5-6- محلول هاي لازم جهت الكتروفورز روي ژل SDS-PAGE 44

3-5-6-1- بافر لودینگ نمونه ((Sample loading buffer 44

3-5-6-2- بافر تانك يا بافر حركت (Running Buffer) 44

3-5-6-3- محلول APS ( ‌آمونيوم پرسولفات ) 45

3-5-6-4- محلول Tris 1 M 45

3-5-6-5- محلول %40 آكريل آميدو بيس آكريل آميد 45

3-5-6-6- محلول رنگ بر 45

3-5-6-7- محلول رنگ كوماسي بلو. 46

3-5-6-8- محلول کلرید کلسیم 5/2 مولار 46

3-5-6-9- محلول (PH=8) EDTA0.5 M.. 46

3-5-7- محلول 10نرمال Na OH.. 47

3-5-8- محلول هاي لازم جهت وسترن بلاتينگ 47

3-5-8-1 بافر انتقال (Transfer) وسترن بلات.. 47

3-5-8-2- محلول Blocking. 47

3-5-8-3- محلول TBS 20X.. 48

3-5-8-4- TBS1X.. 48

3-5-8-5- TBST1X.. 48

3-5-8-6- بافر حاوي سوبستراي آنزيم پراكسيداز(HRP) 48

3-5-9- محلول (isopropyl b-D- thiogalactopyranoside) IPTG.. 49

3-5-10- محلول X-gal (5-Bromo-4-choro-3-Indolyl-b-D-galactorside) 49

3-5-11- محلول های کروماتوگرافی. 49

3-5-11-1- محلول Lysis buffer or washing buffer 49

3-5-11-2- محلول Eluting buffer 49

3-6- روش ها 50

3-6-1- كشت سلول هاي Hep G2. 50

3-6-2- استخراج RNA.. 51

3-6-3- تهيه cDNA از mRNA.. 52

3-6-4- واكنش زنجيره اي پليمر از PCR.. 53

3-6-4-1- تركيبات يك واكنش زنجيره اي پليمراز 53

3-6-4-2- مراحل واكنش PCR.. 55

3-6-4-3- الكتروفورز ژل آگارز 56

3-6-4-4- تهيه ژل آگارز %5/1. 57

3-6-4-5- مرحله لودينگ (Loading) 57

3-6-4-6- مرحله الكتروفورز 57

3-6-4-7- بازيافت محصول PCR از ژل آگارز با نقطه ذوب پايين. 57

3-7- تكنولوژي DNA نوتركيب.. 58

3-7-1- ناقلين كلونينگ ياوكتورها 59

3-7-2- پلاسميدها 59

3-7-3- كلونينگ TA.. 59

3-7-4- اتصال قطعات DNA به يكديگر. 60

3-7-5- انجام وكنش ligation. 61

3-7-6- تهيه سلول مستعد پذيرش (Competent Cells) DNA.. 62

3-7-7- ترانسفورماسيون (Transformantion) 63

3-7-8- غربالگري كلوني هاي واجد پلاسميد نوتركيب.. 63

3-7-9- استخراج پلاسميد با روش ليز قليايي. 64

3-7-10- استفاده از برش هاي آنزيمي براي تاييد كلونينگ.. 65

3-7-10-1- هضم آنزيمي پلاسميد نوتركيب توسط آنزيم هاي SalI و KpnI 65

3-8- ساب كلونينگ در وكتور بيان. 66

3-9- بيان ژن پلاسميد نوتركيب 68

3-9-1- انتقال DNA (پلاسميد) به باكتري زنده BL21. 68

3-9-2- القا كردن بيان پروتئين پلاسميد با IPTG 68

3-9-3- روش كار 68

3-9-4- تهيه نمونه لازم جهت SDS-PSGE. 69

3-9-5- تاييد بيان ژن 70

3-9-5-1- ارزيابي و تفكيك پروتئين ها به روش SDS-PAGE. 70

3-9-5-2- ساخت ژل SDS-PAGE 59

3-10- تولید آنتی بادی پلی کلونال در موش.. 73

3-11- تست ژل دیفیوژن (Gel diffugen) 74

3-12- تست Dot blot 74

3-12- تكنيك وسترن بلاتينگ 75

3-13-1- مراحل وسترن بلاتینگ.. 76

3-14- کروماتوگرافی تمایلی. 77

3-14-1- تهیه نمونه برای کروماتوگرافی. 79

3-14-2- مراحل تخلیص پروتئین نوترکیب با استفاده از ستون کروماتوگرافی Ni-TED.. 79

فصل چهارم 80

نتایج. 80

4-1- نتایج حاصل از کشت سلول های HepG2. 81

4-2 – نتایج حاصل از RT-PCR ژن Human Albumin. 82

4-3 – نتایج حاصل از PCR ژن Human Albumin. 83

4-4 – نتایج حاصل از غربالگری پلاسمید نوترکیب Bluescript / HSA در پلیت 85

4-5- نتایج حاصل از PCR پلاسمید نوترکیب Bluescript / HSA 85

4-6- نتایج حاصل از برش آنزیمی پلاسمید Bluescript/HSA.. 86

4-7- نتایج حاصل از برش آنزیمی پلاسمید pGE-30244-Human Albumin. 87

4-8- نتایج حاصل از ساب کلون. 88

4-8-1- نتایج حاصل از لیگاسیون ژن HSA در وکتور pET-22b. 88

4-8-2- نتایج حاصل از الکتروفورز محصول PCR پلاسمید نوترکیب pET-22b/HSA با پرایمرها ی اختصاصی pET-22b. 89

4-8-3- نتایج حاصل از برش آنزیمی پلاسمید نوترکیب pET-22b/HSA.. 90

4-9- نتایج حاصل از ژل دیفیوژن. 91

4-10- نتایج حاصل از بیان ژن. 91

4-11- نتایج حاصل از Western blotting. 93

4-12- نتایج حاصل از کروماتوگرافی. 94

4-13- نتایج حاصل ازDot blot 95

فصل پنجم. 96

بحث وتفسیر. 96

5-1- تغییر پذیری cDNA HSA.. 97

5-2- E.coliمهندسی شده جهت بیان پروتئین های نوترکیب.. 99

5-2-1- E. coli نوع DE3. 99

5-3- موانع موجود در بیان پروتئین های نوترکیب در E.coli 100

5-4- بیان rHSA.. 101

پیشنهادات.. 104

REferences. 105

Abstract. 111

فهرست اشکال

شکل1-1- ساختمان فضایی پروتئین آلبومین انسانی. 16

شکل1-2 – اسید آمینه های موجود در ساختار پروتئین آلبومین انسانی. 18

شکل1-3- سه دومین آلبومین انسانی. 19

شکل1-4- ساختمان فضایی دومین های آلبومین انسانی. 20

شکل1-5- ساختار ژن آلبومین انسانی. 22

شکل1-6 – سلول های HepG2. 25

شکل1-7- مکانیسم اثر استاتین ها 26

شکل1-8- نقشه ژنی وکتور pET-22b. 28

شکل3-1- فلاسک های حاوی سلول وداروها 50

شکل3-2 – نقشه ژنی وکتور Blue Script 61

شکل3-3- نقشه ژنی پلاسمید pGE-HSA.. 66

شکل3-4- نقشه وکتور بیانی pET22b و جایگاه قرار گرفتن ژن HSA درون آن. 67

شکل3-5- آماده سازی ژل SDS-PAGE. 71

شکل3-6 – نمایی از ستون کروماتوگرافی Ni-TED.. 78

شکل4-1- : کشت سلول های HepG2 بعد از تحریک با Statins. 81

شکل4-2- الکتروفورز محصول RT-PCR روی ژل آگاروز 1%. 82

شکل4-3- الکتروفورز محصول PCR روی ژل آگاروز 1%. 83

شکل4-4- کلونی های سفید و آبی. 84

شکل4-5 – الکتروفورز محصول PCR پلاسمید نوترکیب Blue Script/HSA باپرایمر های اختصاصی 85

شکل4-6- الکتروفورز محصول هضم آنزیمی در ژل 1% آگاروز 86

شکل4-7- الکتروفورز محصول هضم آنزیمی در ژل 8/0% آگاروز 87

شکل4-8-1- کلونی های سلول BL21 حاوی پلاسمید نوترکیب pET-22b/HAS. 88

شکل4-8 -2 الکتروفورز محصول PCR پلاسمید نوترکیب pET22b/HSA با پرایمرها ی اختصاصی 89

شکل4-8-3- الکتروفورز محصول هضم آنزیمی در ژل 8/0% آگاروز 90

شکل4-9 – الکتروفورز پروتئین HSA در ژل SDS-PAGE10%. 91

شکل4-10- نمایی کلی از ژل وجایگاه های تعبیه شده روی آن. 92

شکل4-11- رقت های 1:10و1:20از آنتی ژن. 93

شکل4-12- نتیجه حاصل از تست وسترن بلاتینگ.. 93

شکل4-13- وسترن بلاتینگ حاصل از پروتئین تخلیص شده 94

شکل4-14- نتایج حاصل ازDot blot 95

فهرست جداول

جدول1-1- سکانس های اختصاصی وکتور بیان pET-22b. 29

جدول1-2- سطح بیان HSAنوترکیب تولید شده توسط ارگانیسم های مختلف.. 30

جدول3-1- جدول برای مقادیر ساخت ژل Separating10%.. 72

جدول3-2 – جدول مقادیر برای ساخت ژل Stacking. 72

4 دیدگاه برای کلونینگ و بیان ژن آلبومین سرم انسانی

امتیاز 2 از 5

Gosscz – دی 10, 1402

antihistamine nasal spray canada allergy pills for adults best off counter seasonal allergy
امتیاز 2 از 5

Kauf von clonidin als Schlafmittelr – بهمن 27, 1402

Hello, excellent site you have got right now. Online-Apotheke, um nicorette in Frankreich zu kaufen
امتیاز 2 از 5

FloydSlusa – اردیبهشت 1, 1403

medication from mexico pharmacy: Online Pharmacies in Mexico – mexican pharmaceuticals online
امتیاز 2 از 5

PedroFug – اردیبهشت 4, 1403

buying prescription drugs in mexico: mexico drug stores pharmacies – best online pharmacies in mexico

دیدگاه خود را بنویسید

امتیاز 2.00 از 5 از 4 دیدگاه

امتیازدهی 2.00 از 5 در 4 امتیازدهی مشتری

(4 بررسی مشتری)

قیمت اصلی 36,000 تومان بود.قیمت فعلی 25,000 تومان است.

تاریخ ایجاد بهمن 12, 1399
تاریخ بروزرسانی اردیبهشت 4, 1403
فروش 1
دیدگاه 4

شرایط استفاده از محصول

تمام محصولات به ازای پرداخت پروژه تنها قابل استفاده می باشند. این بدین معنی است که برای استفاده از یک یا چند محصول ، لازم به خرید آن محصول است.

مزایای خرید این محصول:

دسترسی به فایل به صورت همیشگی
پشتیبانی رایگان
پشتیبانی 24 ساعته محصول
بازگشت وجه در صورت عدم رضایت مشتری

مشاهده قوانین سایت