بررسي آلودگي فاژهاي لاکتوباسیل‌های بومي جدا شده از  نمونه‌هاي  لبنی ایران

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                          صفحه

خلاصه فارسی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………    1

مقدمه            ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….     2

فصل اول:کلیات

1-1-1- بیان مسئله ………………………………………………………………………………………………………………………………………..    5

1-1-2-ضرورت های خاص ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 7

1-1-3-اهداف عملی و کاربردی ………………………………………………………………………………………………………………………..  7

1-1-4-پرسش های اصلی تحقیق ……………………………………………………………………………………………………………………   7

1-1-5-فرضیه ها ………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 8

1-2- غذاهای تخمیری و تاریخچه بشریت………………………………………………………………………………………………………..  8

1-2-1- خصوصیات غذاهای تخمیری………………………………………………………………………………………………………………   9    1-2-1-1- نگه داری………………………………………………………………………………………………………………………………………..   10

1-2-1-2- تغذیه………………………………………………………………………………………………………………………………………………   10

1-2-1-3- عملکرد……………………………………………………………………………………………………………………………………………  10

1-2-1-4- خواص ارگانولپتیکی……………………………………………………………………………………………………………………..    11

1-2-1-5- منحصر به فرد بودن……………………………………………………………………………………………………………………..    11

1-2-1-6- ارزش اقتصادی……………………………………………………………………………………………………………………………..    11

1-3- باکتری های لاکتیکی ………………………………………………………………………………………………………………………….    11

1-3-1- نقش باکتری های اسید لاکتیک در صنایع غذایی ………………………………………………………………………..    13

1-3-2- متابولیسم باکتری های اسید لاکتیک ……………………………………………………………………………………………    14

1-3-2-1- باکتری های اسید لاکتیک هموفرمنتاتیو (همگن)…………………………………………………………………….    14

1-3-2-2- باکتری های اسید لاکتیک هتروفرمنتاتیو (ناهمگن)…………………………………………………………………   15  1-4- لاکتوباسیل ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………  17

1-5- طبقه بندی لاکتوباسیل ها……………………………………………………………………………………………………………………..  18

1-6- تاریخچه ی لاکتوباسیل ها …………………………………………………………………………………………………………………….  19

1-7- محصولات . ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..  20

1-7-1- پنیر ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………  20

1-7-1-1- انواع پنیر ………………………………………………………………………………………………………………………………………  20

1-7-1-2- ارزش غذایی پنیر………………………………………………………………………………………………………………………….   20

1-7-2- ماست ……………………………………………………………………………………………………………………………………………….   21

1-8- باکتریوفاژ ………………………………………………………………………………………………………………………………………………   22

1-8-1- نقش باکتریوفاژ در صنایع لبنی شیر ………………………………………………………………………………………………   24

1-8-1-2- منابع اصلی آلودگی فاژی در کارخانجات صنایع لبنی ……………………………………………………………….  24

1-8-3- اثر باکتریوفاژها …………………………………………………………………………………………………………………………………  24

1-8-4- تاریخچه کشف باکتریوفاژ ……………………………………………………………………………………………………………….  25

1-8-5- مورفولوژی باکتریوفاژ ها ………………………………………………………………………………………………………………… 26

1-8-6- طبقه بندی باکتریوفاژ ……………………………………………………………………………………………………………………..  28

1-8-7- مراحل ورود و تکثیر باکتریوفاژ ……………………………………………………………………………………………………….  30

1-8-7-1- مرحله جذب فاژ بر روی سلول باکتری ………………………………………………………………………………………  30

1-8-7-2- مرحله ورود فاژ به داخل باکتری ………………………………………………………………………………………………..  31

1-8-7-3- بیوسنتز ……………………………………………………………………………………………………………………………………….  31

1-8-7-4- رسیدگی کامل ……………………………………………………………………………………………………………………………  31

1-8-8- منشا فاژ …………………………………………………………………………………………………………………………………………..  32

1-8-9- سیکل حیاتی فاژ …………………………………………………………………………………………………………………………….  32

1-8-9-1- سیکل لیتیک    ………………………………………………………………………………………………………………………..  32

1-8-9-2- سیکل لیزوژنیک …………………………………………………………………………………………………………………………  32

1-8-10- روش جداسازی فاژ ………………………………………………………………………………………………………………………  34

1-8-10-1- روش مستقیم ………………………………………………………………………………………………………………………….  34

1-8-10-1-1-روش های میکروبیولوژی …………………………………………………………………………………………………….  34

1-8-10-1-2- روش مولکولی …………………………………………………………………………………………………………………….  34

1-8-10-2 روش غیر مستقیم سنتی ………………………………………………………………………………………………………….  35

1-8-10-2-1- تست فعالیت ………………………………………………………………………………………………………………………  35

1-8-10-2-2- تست اندیکاتور …………………………………………………………………………………………………………………..  35

1-8-10-2-3- فلوسایتومتری ……………………………………………………………………………………………………………………  35

1-8-10-2-4- امپدانس الکتریکی یا رسانایی شیر …………………………………………………………………………………..  35

1-8-10-2-5- سنجش پلاک – لکه و رشد – توربیدومتری …………………………………………………………………….  36

1-8-10-2-6- انواع PCR  …………………………………………………………………………………………………………………………  37

1-8-10-2-6-1- …..Mutiplex PCR……………………………………………………………………………………………………….  37

1-8-10-2-6-2- Quntitive PCR………………………………………………………………………………………………………….  37

1-8-10-2-6-3- Traditional PCR  …………………………………………………………………………………………………….  38

1-8-11- کنترل فاژ …………………………………………………………………………………………………………………………………….  38

1-9- مقاومت انتی بیوتیک ………………………………………………………………………………………………………………………….  40

1-9-1- مقاومت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل های پروبیوتیک ……………………………………………………………………..  42

1-9-2- انواع مقاومت  آنتی بیوتیک …………………………………………………………………………………………………………..  43

1-9-3- انتقال ژن های افقی لاکتوباسیل های پروبیوتیک ……………………………………………………………………….. 43

1-9-4- عوام ضد باکتریایی………………………………………………………………………………………………………………………….. 43

1-9-4-1- آنتی بیوتیک ها………………………………………………………………………………………………………………………….. 45

1-9-5- مکانیسم آنتی بیوتیک ها ………………………………………………………………………………………………………………  45

1-9-5-1- آنتی بیوتیک ها ی ممانعت کننده از سنتز دیواره سلول…………………………………………………………   47

1-9-5-1-1- آنتی بیوتیک های بتالاکتام …………………………………………………………………………………………………  48

1-9-5-2- مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک بتالاکتام …………………………………………………………………………………  48

1-9-5-2-1- پنی سیلین ها ……………………………………………………………………………………………………………………..  49

1-9-5-2-2- سفالوسپورین ها و سفامایسین ها ………………………………………………………………………………………..  50

1-9-5-2-3- گلیکوپپتیدها ………………………………………………………………………………………………………………………..  51

1-9-5-2-4- پلی پپتید ها ………………………………………………………………………………………………………………………..  51

1-9-5-2-5- ایزونیازید، اتیونامید، اتامبتول و سیکلوسرین ……………………………………………………………………… 52

1-9-5-3- انتی بیوتیک های مهار کننده سنتز پروتئین ………………………………………………………………………….. 52

1-9-5-3-1- آمینوگلیکوزید ها …………………………………………………………………………………………………………………  52

1-9-5-3-2- تتراسایکلین ……………………………………………………………………………………………………………………….   54

1-9-5-3-2-1- مقاومت به تتراسایکلین …………………………………………………………………………………………………   54

1-9-5-3-3- اگزازولیدین ………………………………………………………………………………………………………………………..   54

1-9-5-3-4- کلرامفنیکل …………………………………………………………………………………………………………………………  55

1-9-5-3-5- ماکرولیدها …………………………………………………………………………………………………………………………..  55

1-9-5-3-5-1- مقاومت به ماکرولید ها ………………………………………………………………………………………………….  55

1-9-3-6- کلیندامایسین …………………………………………………………………………………………………………………………. 56

1-9-3-7- استرپتوگرامین ………………………………………………………………………………………………………………………  56

1-9-5-4- آنتی بیوتیک های مهار کننده اسید نوکلوئیک ………………………………………………………………………. 57

1-9-5-4-1- کینولون ها ………………………………………………………………………………………………………………………….  57

1-9-5-4-2- ریفامپین و ریفابوتین ………………………………………………………………………………………………………..   57

1-9-5-4-3- مترانیدازول ………………………………………………………………………………………………………………………..   58

1-9-5-4-4- آنتی متابولیت ها ………………………………………………………………………………………………………………..  58

1-9-6-1- اهمیت مقاومت آنتی بیوتیک ها در دام …………………………………………………………………………………  59

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

2-1- تاریخچه …………………………………………………………………………………………………………………………………………..  62

2-2- مطالعات انجام شده در باکتریوفاژ …………………………………………………………………………………………………..  62

2-3- مقاومت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل ها …………………………………………………………………………………………….  64

 

فصل سوم: مواد و روش کار

3-1- دستگاه های مورد نیاز ……………………………………………………………………………………………………………………..  68

3-2- لوازم مورد نیاز …………………………………………………………………………………………………………………………………..  69

3-3- مواد مورد نیاز …………………………………………………………………………………………………………………………………….  69

3-4- سویه های میکروبی مورد مطالعه ……………………………………………………………………………………………………… 71

3-4-2- آماده سازی محیط های کشت ……………………………………………………………………………………………………..  71

3-4-2-1- محیط های کشت MRS  آگار ………………………………………………………………………………………………..  72

3-4-2-2- محیط های کشت نرم MRS  آگار …………………………………………………………………………………………  72

3-4-2-3- محیط کشت MRS  مایع ……………………………………………………………………………………………………….  72

3-5- کشت و آزمایشات تعین هویت باکتری  …………………………………………………………………………………………..  72

3-6- سنجش فاژ ………………………………………………………………………………………………………………………………………..  73

3-6-1- روش دو لایه ای پلاک …………………………………………………………………………………………………………………  73

3-6-2- مشاهده پلاک توسط القاء با پرتو UV ……………………………………………………………………………………….  73

3-6-3- آزمون Heap and Lawrence …………………………………………………………………………………………………  74

3-7- سنجش حساسیت نسبت به آنتی بیوتیک ………………………………………………………………………………………  75

3-7-2- آزمایش تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش انتشار دیسک در آگار ( دیسک دیفیوژن) …..  76

3-7-2-1- روش انجام آزمایش دیسک گذاری ………………………………………………………………………………………   76

3-7-2-1-1- تهیه محیط کشت ……………………………………………………………………………………………………………   76

3-7-2-1-2- روش کار …………………………………………………………………………………………………………………………..  77

 

فصل چهارم : نتایج

4-1- شرح مختصری از مطالعه ……………………………………………………………………………………………………………….  80

4-2- نتایج ………………………………………………………………………………………………………………………………………………..  80

4-2-1- نتایج حضور یا عدم حضور فاژ در سویه ها …………………………………………………………………………………  81

4-2-2- نتایج مشترک جداسازی فاژ در روش القاء  UV و میتومایسین C  ………………………………………….  83

4-2-3- نتایج مشترک جداسازی فاژ در روش القاء با میتومایسین C و Heap and Lawrence  ………….. 83

4-2-4- نتایج مشترک جداسازی فاژ در روش القاء با پرتو UV و Heap and Lawrence ……………………  84

4-3- نتایج حساسیت ومقاومت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل ها …………………………………………………………………. 84

4-4- نتایج میزان درصد حساسیت و مقاومت سویه ها به آنتی بیوتیک …………………………………………………  91

4-5-1- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به آمینوگلیکوزید ها   92

4-5-2- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به سفالوسپورین ها ..  92

4-5-3- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به گلیکوپپتیدها …….  93

4-5-4- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به لینکوزامید ها …….  93

4-5-5- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به ماکرولیدها …………  94

4-5-6- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به پنی سیلین ها …..  94

4-5-7- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به کینولون ها ………..  95

4-5-8- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به سولفانامید ها ………  95

4-5-9- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به تتراسایکلین ها…….. 96

4-5-10- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به دیگر آنتی بیوتیک‌ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….  96

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری  

5-1- اهمیت جداسازی فاژ ……………………………………………………………………………………………………………………….   99

5-2- نتایج جستجو برای جداسازی فاژ ……………………………………………………………………………………………………  100

5-3- اهمیت الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی پروبیوتیک ها ……………………………………………………………………  102

5-4- راه های انتقال ژن های مقاومت به آنتی بیوتیکی در لاکتوباسیل ها …………………………………………….  103

5-5- نتایج تفسیر برای الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی …………………………………………………………………………   104

5-6- پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………………………………………………….  109

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….  111

ضمائم

پوسترهای ارائه شده در پانزدهمین کنگره بین المللی  میکروب شناسی ایران ……………………………………… 121

خلاصه انگلیسی ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 12۳

فهرست جداول

جدول 1-1- مورفولوژی باکتریوفاژهای اسید لاکتیک ………………………………………………………………………………  30

جدول 1-2- گروه های آنتی بیوتیکی و مکانیسم عمل آن ها ………………………………………………………………….  46

جدول 1-3- پنی سیلین ها و طیف اثر آن ها …………………………………………………………………………………………..  49

جدول 1-4- مثال های انتخابی از سفالوپورین ها و سفامایسین و طیف اثر آن ها ………………………………….  50

جدول 1-5- ماکرولیدها وتتراساسکلین …………………………………………………………………………………………………….  56

جدول1-6- کینولون ها …………………………………………………………………………………………………………………………….   57

جدول 3-1- دستگاه های مورد استفاده در تحقیق به همراه مدل آن ها ……………………………………………….  68

جدول 3-2- مواد مورد نیاز در آزماشی به همراه کشور سازنده آن ها …………………………………………………….  70

جدول 3-3- دیسک های آنتی بیوتیک مورد استفاده جهت آنتی بیوگرام در این مطالعه …………………….   75

جدول 4-1- نتایج حضور یا فقدان فاژ در سویه ها با استفاده از 3 روش مختلف …………………………………..  81

جدول 4-2- نتایج قطر هاله عدم رشد و الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی برای سویه های لاکتوباسیل بومی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….  85

جدول 4-3- میزان درصد حساسیت و مقاومت سویه های به آنتی بیوتیک …………………………………………..  91

فهرست شکل ها

شکل 1-1- روش تخمیر همولاکتیکی در باکتری های اسید لاکتیک …………………………………………………….. 16

شکل 1-2- تخمیر هترولاکتیکی باکتری های اسید لاکتیک ………………………………………………………………….  17

شکل 1-3- شمای کلی باکتریوفاژ ……………………………………………………………………………………………………………  23

شکل 1-4- سیکل حیاتی لیتیک و لیزوژنیک باکتریوفاژ …………………………………………………………………………  33

شکل 3-1- پلاک …………………………………………………………………………………………………………………………………….   74

شکل 3-2- اندازه گیری هاله عدم رشد ………………………………………………………………………………………………….  78

فهرست نمودارها

4-1- نمودار نتایج مقایسه 3 روش مختلف برای جداسازی فاژ ……………………………………………………………..  83

4-2-1- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به آمینوگلیکوزیدها ………. 92

4-2-2- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به سفالوسپورین ها……….  92

4-2-3- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به ونکومایسین ……………   93

4-2-4- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به کلیندامایسین………….   93

4-2-5- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به اریترومایسین………….    94

4-2-6- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به پنی سیلین ها …………  94

4-2-7- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به کینولون ها………………….95

4-2-8- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به کوتریماکسازول ……….  95

4-2-9- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به تتراسایکلین ……………  96

4-2-10- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به کلرامفنیکل و نیتروفورانتوئین…………………………………………………………………………………………………………………………………….    96

4-2-11- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به میتومایسین………..  97