%53تخفیف

کلونینگ، بررسی بیان و ترشح آلفا آمیلاز حاصل از باسیلوس KR8104 در باسیلوس سوبتیلیس 1A772

تعداد 119صفحه در فایل word

چکیده

تقاضاي روز افزون براي آنزیمهای صنعتی و قيمت بالاي آنها، موجب شده است كه استفاده از سیستمهای بیانی مختلف براي توليد آنزیمهای صنعتی مدنظر قرار گيرد و پروتئینهای نوترکیب ارزشمندی را بدین طریق میتوان در مقیاس زیاد و به قیمت ارزان تولید کرد. در سالهای اخیر بین میزبانهای باکتریایی که برای تولید آنزیمهای صنعتی معرفی شدهاند به باسیلوس توجه زیادی شده است که میتوان به سویهی سوبتیلیس1A772 اشاره کرد که توانایی ترشح آنزیم به محیط کشت را دارد اهمیت این امردر این است که باعث تسهیل وارزانتر شدن فرآیندهای پایین دست در بیوتکنولوژی میشود .این باکتری به دلیل مزایایی که دارد به عنوان یک بیوراکتور مناسب برای تولید آنزیمهای صنعتی با ارزش معرفی شده است که عبارتند از: پروتئازهای خارج سلولی آن مهار شده هست، انکلوژون بادی نمی دهد و ساخت وترشح آنزیم با مقدار بیشتر( به علت حضور پروموتر قوی در وکتور طراحی شده) اتفاق مي افتد. ضرورت توليد پروتئینهای نوترکيب از منابع دائمي و ارزان، اجتناب ناپذير میباشد. از آنجا که تا کنون گزارشی مبنی بر تولید آنزیم آلفا آمیلاز در باسیلوس سوبتیلیس در ایران دریافت نشده است و همچنین در E.coli اغلب سطح بیان، پایین میباشد لذا این تحقیق میتواند زمینه تولید این آنزیم را از منابع دائمي و ارزان ایجاد کند. بدینمنظور ژن آميلاز از TA وكتور با سايت هاي برشيBamH1, XbaI (با روش double digest) جداسازي شد. سپس آميلاز آماده را در وكتور PAL10(كه قابليت ورود به E.coli وBacillus را دارد.) كلون كردیم. با کلون کردن ژن مورد نظر و Transformation به داخل باکتري Ecoli Bl21 (DE3) ligation تاييد و آنزيم نوتركيب تكثير یافت. در مرحله بعد مولكول نوتركيب از E.coli جداسازي شد و به باسيلوس سوبتيليس انتقال یافت و دراخرین مرحله بررسي بیان وترشحي بودن آميلاز و بهينه سازي بيان آن صورت گرفت. در اين پروژه براي اولين بار ژن آنزيم مورد نظر در وکتور مناسب کلون شده و پس از بيان آنزيم، خصوصيات بيوشيميايي آنزيم مطالعه خواهد شد. از سوی دیگر در مطالعات قبلي در آزمايشگاه آنزيم شناسي، آنزيم وحشي( Wild type ) تخليص شده و ساختار سه بعدي آن بدست آمده است.ژن اين آنزيم پروتئيني با659 آمينو اسيد كد ميكند كه علاوه بر ناحيه 422 آمينو اسيدي به دست آمده در كريستالوگرافي داراي دو پپتيد ديگر يكي 44 آمينو اسيدي در انتهاي آمين (با مشخصات پپتيدهاي نشانه ) و ديگري 193 آمينو اسيدي در انتهاي كربوكسيل است. بمنظور بدست آوردن نقش C- پپتید در مسیر ترشحی باکتریهای گرم مثبت؛ نیاز به مقایسه مقدار ترشح آنزیم در حضور و عدم حضور این قطعه بود. به این منظور دو قسمت از ژن bka با و بدون پپتید انتهای کربوکسیل در پلاسمید بیانی pAL10 کلون شده و ترشح پروتئین های حاصله در باکتری Bacillus Subtilis1A772مورد بررسی قرار گرفت. مشخص كرد كه آنزيم با پپتيد انتهاي كربوكسيل بيشتر از آنزيم بدون اين قطعه در محيط خارج سلولي حضور دارد. در نتيجه پپتيد انتهاي كربوكسيل ترشح پروتئين به محيط كشت را افزايش ميدهد.

aکلمات کلیدی: آلفا –آمیلاز؛گونه باسیلوس سوبتیلیس1A772. وکتور pAL10؛ پپتید C-؛ مسیر ترشحی

دسته: زیست شناسی, علوم تجربی برچسب: aکلمات کلیدی: آلفا –آمیلاز؛گونه باسیلوس سوبتیلیس1A772. وکتور pAL10؛ پپتید C-؛ مسیر ترشحی

توضیحات

فهرست مطالب:

فصل 1- مقدمه. 1

1-1- آنزيم ها 2

1-2- بازار جهاني آنزيم. 3

1-3- ساختار مولکولي آلفا آميلازها 3

1-3-1- دمين هاي آلفا آميلاز 3

1-3-2- جايگاه فعال آلفا آميلازها 5

1-3-3- يون کلسيم. 5

1-4- توالي اسيد آمينه اي و نواحي حفظ شده آلفا آميلازها 6

1-5- آنزيم آلفا آميلاز از سويه باکتريايي8104 Bacillus sp. KR.. 6

1-6- ژن آنزيم آلفا آميلاز از سويه باکتريايي Bacillus sp. KR8104. 7

1-7- مقايسه توالي اسيدآمينه اي استنتاج شده از توالي ژن کامل آلفا آميلاز سويه Bacillus sp. KR8104 با نتايج به دست آمده از مطالعه کريستالوگرافي اشعه ايکس اين آنزيم 9

1-8- سرنوشت 44 اسيدآمينه انتهاي آمينی. 10

1-9- ترشح پروتئین در باکتریها 11

1-9-1- مسیرهای ترشحی در باکتریهای گرم منفی. 11

1-9-2- مسیرهای ترشح پروتئین در باسیلوس سوبتیلیس… 21

1-10- اهميت فنون DNA نوترکيب.. 22

1-10-1- انتخاب ميزبان بيان ژن. 23

1-10-2- راهبردهاي نسخه برداري (انتخاب حاملين بيان ژن) 24

1-10-3- سيستم بيانpAL10. 26

1-11- ترشح پروتئین نوترکیب در Bacillus Subtilis 29

1-12- غلبه بر مشکل محدودیت اکسیژن. 30

1-13- استفاده از میزبان های فاقد پروتئاز 31

1-14- الحاق DNA به کروموزوم میزبان. 31

1-15- تعريف مساله. 34

1-16- افزایش ترشح پروتئین. 34

1-17- اثر پپتید انتهای کربوکسیل بر خصوصیات آنزیم. 37

1-18- اهداف.. 38

فصل 2- مواد و روش ها 40

2-1- مواد شيميايي. 41

2-2- ميكروارگانيسم ها و محيط هاي كشت مورد استفاده 41

2-2-1- ميكروارگانيسم ها و پلاسميدها 41

2-2-2- محيط هاي كشت ميكروبي (gr/lit) 42

2-3- دستورزي ملکول DNA.. 43

2-4- سابکلون کردن قسمتهای مختلف ژن bkaدر ناقل بياني pAL10. 44

2-4-1- طراحي پرايمر 44

2-4-2 استخراج وکتور TA حامل ژن bka از باکتری Escherichia coli XL1-blue. 45

2-4-3- مراحل PCR.. 45

2-4-4- هضم آنزيمي. 47

2-4-5- الحاق. 48

2-4-6- ترانسفورماسيون محصول الحاق به باکتري اشريشيا کولي (XL1-blue)(86) 49

2-4-7- تعيين پلاسميدهاي نوترکيب.. 52

2-4-8- تأييد کلونيهاي نوترکيب.. 53

2-4-9- ترانسفورماسيون پلاسميدpAL10 نوترکيب به درون باکتري باسیلوس سوبتیلیس 1A772: 54

2-5- الکتروفوزر ژل آگارز (85) 56

2-5-1- تهيه بافر الكتروفورز(10X) TBE. 56

2-5-2- تهيه بافر الكتروفورز (50X) TAE. 56

2-5-3- روش كار 57

2-6- القاء باکتري و بيان پروتئينهاي نوترکيب 57

2-6-1- تنظيم بهترین شرایط بیان به منظور بررسی ترشح آنزیم: 58

2-7- بررسي ترشح پروتئينهاي نوترکيب در محیطکشت باکتریها با استفاده از سنجش فعالیت آمیلازی 59

2-8- تهیه جزءهای داخل و خارج سلولی. 59

2-9- الکتروفورز پروتئین ها به روش SDS-PAGE(89) 60

2-9-1- بررسي بيان پروتئينهاي نوترکيب در توده سلولی باکتریها با استفاده از روش الکتروفورز………….. 60

2-9-2- مواد و محلولهاي مورد نياز براي انجامSDS-PAGE. 60

2-9-3- روش انجام SDS-PAGE. 62

2-10- تعيين غلظت پروتئين به روش برادفورد (90) 63

2-11- تعيين فعاليت آنزيمي. 64

2-11-1- روشBernfeld (91) 64

2-12- واحد آنزيمي. 65

فصل 3- نتایج.. 66

3-1- کلونينگ ژن آمیلاز در سويه بياني. 67

3-2- انتخاب کلونيهاي مثبت حاوي ژن مورد نظر 69

3-2-1- روش كراكينگ.. 70

3-2-2- كلوني PCR.. 71

3-2-3- هضم بوسيله آنزيمهاي BamHI و XbaI (double digestion): 72

3-2-4- تعيين توالي ژن آمیلاز کلون شده 73

3-3- بيان ژن آمیلاز 74

3-3-1- تنظيم بهترين شرايط بيان. 75

3-4- تعيين غلظت پروتئين 76

3-5- الکتروفورز پروتئينها به روش SDS-PAGE (94) 76

3-6- خصوصیات کاتالیتیک BKA با و بدون 193 آمینو اسید انتهای کربوکسیل. 78

3-7- بررسي شکل آلفا-آمیلاز ترشح شده به محيط کشت در سويه وحشي KR8104 Bacillus sp……….. 78

3-8- ساب کلون کردن قطعات مختلف ژن bka در حامل بياني pAL10. 79

3-8-1- تکثیر قطعات ژنی مورد نظر 79

3-8-2- هضم آنزيمي محصول PCR و حامل بياني pAL10. 80

3-8-3- الحاق. 80

3-8-4- ترانسفورماسيون و تشخيص كلونيهاي حاوي پلاسميد نوتركيب.. 80

3-9- ترانسفور ماسيون پلاسميد نوتركيب درون باكتري باسیلوس سوبتیلیس… 81

3-10- بيان ژنها 81

3-11- بررسي مقدار آنزيم ترشح شده به محيط كشت باكتري باسیلوس سوبتیلیس… 82

فصل 4- بحث 83

4-1- كليات تحقيق. 84

4-2- سيستم بيانpAL10. 88

4-3- سيستم بيانpAL10. 90

4-4- غلبه بر مشکل محدودیت اکسیژن. 91

4-5- بار متابولیکی. 92

4-6- نقش پپتید انتهای کربوکسیل در ترشح آنزیم در با سیلوس.. 95

4-7- اثر پپتید انتهای کربوکسیل در ترشح BKA در باکتری باسیلوس سوبتیلیس… 98

4-8- تعیین محل اثر پپتید انتهای کربوکسیل در ترشحBKA.. 99

پیشنهادات 101

فهرست منابع 102

فهرست جداول:

جدول ‏2‑1 خصوصيات انواع سويه ها و پلاسميدهاي مورد استفاده در اين پژوهش… 42

جدول ‏2‑2 تهيه استانداردهاي پروتئيني براي تعيين غلظت نمونه هاي مجهول. 64

جدول ‏3‑1 توزیع فعالیت آمیلازی در فضاهای داخل و خارج سلولی باکتریهای باسیلوس سوبتیلیس حاوی وکتورهای نوترکیب p-BKA.. 76

جدول ‏3‑2 توزیع فعالیت آمیلازی در فضاهای داخل و خارج سلولی باکتریهای باسیلوس سوبتیلیس حاوی وکتورهای نوترکیب p-BKA و (p-BKA∆(C193. 82

فهرست شکل‌ها:

شکل ‏1‑1 آلفا آميلاز بدست آمده از باسيلوس سوبتيليس که سوبستراي مالتوپنتا اوز به جايگاه فعال آن متصل شده است. A، B و C با رنگ هاي سبز، صورتي و آبي و يون هاي کلسيم با توپ هاي قرمز رنگ و سوبستراي متصل شده با رنگ زرد مشخص شده است. 5

شکل ‏1‑2 تطبيق چهار ناحيه حفظ شده بين آلفا آميلازها 6

شکل ‏1‑3 ترادف 659 اسيد آمينه اي استنتاج شده از ژن bka که در مقایسه با ترادف حاصل از ساختار کریستالی دو پپتید اضافهتر دارد: یکی 44 آمينواسيدی در انتهاي آمينو و دیگری 193 آمينواسيدی در انتهاي کربوکسيل. 10

شکل ‏1‑4 44 آمینو اسید انتهای آمینو در BKA؛ این پپتید نیز مانند پپتیدهای نشانه نوع Sec دارای سه ناحیه باردار مثبت (ناحیه N)، هیدروفوب (ناحیه H) و قطبی (ناحیه C) است. ناحیه P از 11 آمینو اسید تشکیل شده و بعد از پپتید نشانه قرار دارد. 11

شکل ‏1‑5 نمایش شماتیک مسیرهای ترشحی وابسته به Sec و مستقل از Sec در باکتریهای گرم منفی. 13

شکل ‏1‑6 مکانیسم “همزمان با ترجمه” و مکانیسم “پس از ترجمه” در مسیر Sec. 14

شکل ‏1‑7 پپتید نشانه نوع Sec؛ این پپتید دارای سه ناحیه باردار مثبت (ناحیه N)، هیدروفوب (ناحیه H) و قطبی (ناحیه C) بوده که در بین تمام موجودات زنده حفاظت شده است. 15

شکل ‏1‑8 پپتید نشانه در مسیر Tat؛ این پپتید دارای دو آمینو اسید آرژنین بهدنبال هم در ترادف حفاظت شده R/K-R-X-#-# هستند. 17

شکل ‏1‑9 پروتئاز IgA1؛ دمین کمککننده به صورت بشکه بتا در غشا تاخورده و کانالی برای عبور قسمت بالغ ایجاد کرده است. 19

شکل ‏1‑10 سیستم سه جزئی مسیر ABC همراه با سوبسترای پروتئینی آن. 20

شکل ‏1‑11 نمایشی شماتیک از مسیرهای ترشح پروتئین در باسیلوس سوبتیلیس (75). مسیر Sec (1)؛ مسیر Tat (2)؛ مسیر ABC (3)؛ عملکرد بعضی از اجزا سیستمهای ترشحی (Sec A, Sec DF, Sig) در سطوح پس از ترجمه توسط Ecs ABC transporter کنترل میشود (+). اجزا سیستمهای ترشحی با جزئیات نشان داده نشده است. 22

شکل ‏1‑12 وکتور بیانی pAL10 حاوی cold-inducible des promoter مربوط به باسیلوس سوبتیلیس 28

شکل ‏1‑13 محصولات نوترکیب تولید شده به منظور بررسی اثر قطعه انتهای کربوکسیل. 38

شکل ‏3‑1 الکتروفورز محصول واکنش PCR 1) اندازهنماي DNA 2) محصول PCR ژن کد کننده آنزیم BKA∆(C193) و 3) محصول PCR ژن کد کننده آنزیم BKA.. 67

شکل ‏3‑2 پلاسميد pAL10خطي شده بوسيله هضم آنزيمهاي محدودکننده BamHI وXbaI. پلاسميد خطي شده در ناحيه بين 7000 و 8000 جفت بازي اندازه نماي DNA مشخص ميباشد. M: اندازه نماي DNA؛P : پلاسميد خطي شده است. 68

شکل ‏3‑3 پلیت حاصل از ترانسفورم محصول الحاق در باکتری مستعد XL1-blue؛ کلنیهای تشکیل شده ژن مقاومت به آنتیبیوتیک آمپیسیلین را که روی وکتور pAL10است، دریافت کردهاند. 69

شکل ‏3‑4 پلیت تقسیمبندی شده حاوی کلونیهای حاصل از ترانسفورم؛ به منظور بررسی حضور قطعه ژن در پلاسمیدها با روش کراکینگ، این پلیت به عنوان منبع اصلی باکتری تهیه شده است. 70

شکل ‏3‑5 ژل آگارز حاصل از کراکینگ باکتریهای دریافتکننده محصول الحاق مربوط به ژن کد کننده BKA .در این روش پس از لیز باکتریها الکتروفورز روی ژل آگارز انجام میشود. mRNA های میزبان سریعتر حرکت کرده و پایینترین بخش را تشکیل میدهند. ملکولهای DNA ژنومی در بالاترین قسمت و پلاسمیدهای آن در وسط قرار میگیرند. پلاسمیدهای نوترکیب به علت داشتن قطعه ژنی بالاتر از پلاسمید تنها قرار میگیرد. 71

شکل ‏3‑6 الکتروفورز محصول واکنش PCR 1)اندازهنماي DNA 2)محصول PCR ژن کد کننده آنزیم BKA∆(C193) و 3)محصول PCR ژن کد کننده آنزیم BKA.. 72

شکل ‏3‑7 هضم بوسيله آنزيمهاي BamHI و XbaIصحت حضور قطعه DNAهدف بررسي و تاييد شد.باند 1716bp مربوط به آمیلاز وباند 6700bp مربوط به پلاسمیدpAL10. 73

شکل ‏3‑8 SDS-PAGE آلفاآمیلاز 1)استاندارد جرم مولکولی پروتئین 2)محیط کشت تغلیظ شده 77

شکل ‏3‑9 الکتروفورز محصول واکنش PCR 1)اندازهنماي DNA 2) محصول PCR ژن کد کننده آنزیم BKA∆(C193) و 3) محصول PCR ژن کد کننده آنزیم BKA.. 80

شکل ‏4‑1 نتایج حاصل از کریستالوگرافی و ترادف ژنی. 96

شکل ‏4‑2 مقایسه مقدار ترشح آنزیم در حضور و عدم حضور این قطعه C پپتید. 100

امتیاز 0 از 5 از 0 دیدگاه

قیمت اصلی 45,000 تومان بود.قیمت فعلی 21,000 تومان است.

تاریخ ایجاد مهر 29, 1399
تاریخ بروزرسانی اسفند 13, 1401
فروش 1
دیدگاه 0

شرایط استفاده از محصول

تمام محصولات به ازای پرداخت پروژه تنها قابل استفاده می باشند. این بدین معنی است که برای استفاده از یک یا چند محصول ، لازم به خرید آن محصول است.

مزایای خرید این محصول:

دسترسی به فایل به صورت همیشگی
پشتیبانی رایگان
پشتیبانی 24 ساعته محصول
بازگشت وجه در صورت عدم رضایت مشتری

مشاهده قوانین سایت