فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه. 2
1-1- منشاء. 3
1-2- اصطلاح‌شناسي. 4
1-3- انواع ميخك. 4
١-4- گياه‌شناسي و ريخت‌شناسي ميخك. 5
١-5- روش‌هاي افزايش ميخك. 7
1-6- اهميت و اهداف پژوهش. 7
فصل دوم: مروري بر پژوهش هاي پيشين. 10
2-1- ريزافزايي و کشت بافت ميخک. 10
2-1-1- گزينش ريزنمونه و گندزدايي سطحي آن. 10
2-1-2- ريخت زايي و باززايي. 12
2-1-3- رويان زايي بدني. 13
2-1-3-1- تنظيم کننده هاي رشد. 14
2-1-3-2- محيط پينه زايي. 16
2-1-3-3- محيط ريشه زايي. 17
2-1-3-4- سن مواد گياهي و شرايط كاشت. 18
2-1-4- مسيرهاي رويان زايي بدني. 19
2-2- انتقال ژن توسط اگروباكتريوم. 19
2-2-1- اساس ايجاد گال و پلاسميد Ti 20
2-2-2- انتقال T– DNA.. 20
2-2-3- عوامل مؤثر بر انتقال توسط اگروباكتريوم. 22
2-2-3-1- نژادگان (ژنوتيپ). 22
2-2-3-1-1- ريزنمونه هاي شروع كننده. 22
2-2-3-1-2- سويه باكتري. 24
2-2-3-1-3- چگالي نوري. 25
2-2-3-1-4- انگيزاننده هاي ژن هاي بيماري زا. 26
2-2-3-1-5- مدت زمان هم كشتي. 27
2-2-3-1-6- گزینش با کانامیسین. 28
فصل سوم: مواد و روش‌ها. 30
3-1- كشت بافت. 30
3-١-1- مواد گياهي. 30
3-١-2- قسمت‌هاي گياهي مورد استفاده در كشت بافت. 30
3-١-٣- گندزدايي ريزنمونه‌ها و وسايل. 31
3-١-4- آماده‌سازي ريزنمونه‌ها برای استقرار. 32
3-١-5- محيط كشت. 32
3-2- انتقال توسط اگروباکتریوم. 34
3-2-1- مواد. 34
3-2-1-1- بافر STET. 34
3-2-1-2- بافر الكتروفورز. 34
3-2-1-3- بافر CTAB.. 35
3-2-1-4- بافر TE. 35
3-2-1- 5- بافر سنجش GUS. 35
3-2-1-6- بافر بارگذاری. 35
3-2-1-7- محلول ذخيره آنتي بيوتيك كاناميسين. 36
3-2-1-8- محلول ذخيره آنتي بيوتيك ريفامپيسين. 36
3-2-1-9- محلول ذخیره آنتی بیوتیک سفاتاکسیم. 36
3-2-1-10- محلول ذخیره استوسیرینگون. 36
3-2-1-11- محلول ذخیره نفتالن استیک اسید. 37
3-2-1-12- محلول ذخیره بنزیل آدنین. 37
3-2-1-13- محيط كشت LB (Luria–Bertani) 37
3-2-1-14- سويه A. tumefaciens. 37
3-3- روش ها. 38
3-3-1- تهیه ریزنمونه. 38
3-3-2- تهيه محيط هاي كشت بافت گياهي. 38
3-3-3- آغازگرها. 40
3-4- روش ها. 40
3-4-1- آماده سازي باكتري براي انجام انتقال ژن به ريزنمونه ها 40
3-4-2- استخراج DNA پلاسمیدهای نو ترکیب. 41
3-4-3- آماده سازي ريزنمونه ها و اگروباكتريوم برای انتقال ژن به میخک 42
3-4-4- پیش آماده سازی ریزنمونه ها. 43
3-4-5- روش کار انتقال ژن به گیاه. 43
3-4-6- گزینش و باززايي گياهان تراریخت. 44
3-4-7- استخراج DNA از بافت هاي گياهي با استفاده از محلول CTAB 45
3-4-9- روش کار. 47
3-4-10- آزمون زنجیره ای پلیمراز ((PCR.. 49
3-4-11- تهيه ژل آگارز و انجام الکتروفورز براي بررسي نتايج آزمون PCR 51
3-4-12- آزمون شيميايي- بافتي برای تعيين فعاليت تراریخت GUS در شاخسارههاي تراریخت. 51
3-4-13- واکاوی داده ها. 52
فصل چهارم: نتايج و بحث. 54
4-1- کشت بافت. 54
4-1-1- تشکیل شاخساره نابجا از ریزنمونه های برگ ارقام استاندارد و مینیاتور میخک. 54
4-1-1-1- مواد گیاهی. 54
4-1-1-2- گندزدایی. 54
4-1-1-3- ریزنمونه ها و محیط باززایی. 55
4-2- انتقال ژن با واسطه اگروباکتریوم. 56
4-2-1- آزمايش مقدماتي. 58
4-2-1-1- گزينش با کاناميسين. 58
4-2-2- توليد گياهان تراریخت. 61
4-2-3- تأييد گياهان تراریخت با سنجش فعاليت GUS. 63
4-3- آناليز PCR.. 64
4-4- تأثير غلظت باکتري. 67
4-5- تاثير زمان مايه زني. 71
4-6- تاثير مدت زمان هم کشتي بر کارايي انتقال ژن. 69
4-7- برهمكنش سه عامل چگالي نوري باکتري، مدت زمان مايه زني ريزنمونه ها با باکتري و مدت زمان هم کشتي. 73
پيشنهادها. 77
منابع. 78
فهرست جدولها
عنوان صفحه
جدول 1-3- مواد تشکیل دهنده محلولهاي پايه محيط كشت MS. 34
جدول 2-3- انواع محیط های کشت مورد استفاده.. 40
جدول 3-3- مواد مورد نياز براي استخراج DNA ژنومی 47
جدول 4-3- مواد لازم در واكنش PCR.. 51
جدول 5-3- دوره های دمایی واکنش های PCR.. 51
جدول 1-4- اثر غلظت های مختلف BA و NAA بر تعداد شاخساره های نابجای باززایی شده از ریزنمونه های برگ رقم استاندارد’Rendz-Vous‘ . 57
جدول 2-4- اثر غلظت های مختلف BA و NAA بر تعداد شاخساره های نابجای باززایی شده از ریز نمونه های برگ رقم ’Panamera‘.. 57
جدول 3-4- اندام زايي از ريزنمونه هاي برگ دو رقم ميخک روي محيط داراي کاناميسين با و بدون آلودگي توسط Agrobacterium tumefaciens LBA 4404. 60
جدول4-4- مقایسه تعداد و درصد شاخساره های تراريخت به دست آمده در تیمار چگالی های نوری مختلف باکتری.. 70
جدول 5-4- مقایسه تعداد و درصد شاخساره های تراريخت به دست آمده در مدت زمان های مايه زني ریز نمونه ها با باکتری.. 71
جدول6-4- مقایسه تعداد و درصد شاخساره های تراريخت به دست آمده در مدت زمان های هم کشتی مختلف ریز نمونه ها با باکتری. 74
جدول 7-4- مقایسه درصد شاخساره های تراريخت به دست آمده در سه عامل چگالی نوری باکتری، زمان مايه زني با باکتری و مدت هم کشتی ریز نمونه ها با باکتری در سه سطح مختلف برای رقم ’Rendz-Vous‘. 76
جدول 8-4- مقایسه درصد شاخساره های تراريخت به دست آمده در سه عامل چگالی نوری باکتری، زمان مايه زني با باکتری و مدت هم کشتی ریز نمونه ها با باکتری در سه سطح مختلف برای رقم ’Panamera‛ 77
فهرست نگارهها
عنوان صفحه
نگاره1-3. جايگاه هاي برشي پلاسميد pBI121. 43
نگاره1-4- ایجاد شاخساره و پینه پس از گذشت 8 تا 10 هفته از مایه کوبی برای رقم
Rendz–Vous 63
نگاره 2-4- سنجش ژن GUS در رقم ‘Rendz–Vous‘. 64
نگاره 3-4- سنجش ژن GUS در رقم ‘Panamera‘ 65
نگاره 4-4- نتایج آزمون PCR در رقم ’Rendz–Vous‘. وجود گیاهان تراریخت میخک با جفت آغازگرهای ژن GUS برای تأیید وجود این ژن. چاهک M نشانگر kb10، چاهک 1 کنترل منفی، چاهک 2 تا 7 نمونه های مربوط به گیاهان تراریخت و چاهک 8 و 9 مربوط به گیاهان ناتراریخت…. 66
نگاره 5-4- نتایج آزمون PCR در رقم ‘Panamera‘. گیاهان تراریخت میخک با جفت آغازگرهای ژن gus برای تأیید وجود این ژن. چاهک M نشانگر kb10، چاهک 1 کنترل منفی، چاهک 2 تا 4 نمونه های مربوط به گیاهان تراریخت و چاهک 5 تا 7 مربوط به گیاهان ناتراریخت. 67
نگاره 6-4- سنجش ژن GUS در ریزنمونه های پینه (A,B,C) و اندام های گل (D) باززایی شده در رقم ‘Rendz–Vous‘. 68
کوتاههها
6- بنزیل آمینو پیورین (6-benzyl amino-9-(tetrahydropyran-2– yl)-9H-purine) |
BAP |
پیشبر ویروس موزائیک گل کلم (Cauliflower mosaic virus promotor) |
CaMV 35S |
آب دوبار تقطیر (Double distilled water) |
DDW |
توفوردی (2و4- دیکلروفنوکسی استیک اسید) (2,4-dichlorophenoxy acetic acid) |
2,4-D |
اتیلن دیآمین تترا استیک اسید (Ethylene diamine tetra acetic acid) |
EDTA |
بتاگلوکورونیداز (β-Glucuronidase) |
GUS |
محیط کشت لوریا – برتانی (Luria-Bertani Medium) |
LB |
محیط کشت موراشیگی و اسکوگ (Murashige and Skoog Medium – 1962) |
MS |
نفتالن استیک اسید (Naphthalene acetic acid) |
NAA |
ژن نئومایسین فسفوترانسفراز (Neomycin phosphotransferase gene) |
nptІІ |
پلیوینیلپیرولیدون (Polyvinylpyrolidone) |
PVP |
بافر سوکروز تریس اتیلن دی آمین تترا استیک اسید تریتون (Sucrose tris EDTA tritone buffer) |
STET |
بافر تریس بورات اتیلن دیآمین تترا استیک اسید (Tris burate EDTA buffer) |
TBE |
بافر تریس اتیلن دیآمین تترا استیک اسید (Tris EDTA buffer) |
TE |
DNA منتقل شونده (Transferred DNA) |
T-DNA |
تیدیازرون (Thidiazuron) |
TDZ |
وزن / حجم (Weigh / Volume) |
W/V |
