ژنوتایپینگ سویه های سالمونلا انتریکا سروتایپ اینفانتیس جدا شده از نمونه های بالینی در تهران برپایه روشMLVA

فهرست مطالب

فهرست جداول ‌ی

فهرست تصاویر. ک

فهرست علایم و اختصارها ‌ل

چکیده ی فارسی.. 1

فصل اول : مقدمه

1-1)مقدمه(بیان مسئله و اهمیت آن) 3

1-2) باکتریولوژی سالمونلا.. 5

1-3 )ویژگی های بیوشیمیایی سالمونلا.. 6

1-4) طبقه بندی سالمونلا.. 10

1-4-1) سیستم های طبقه بندی قدیمی برای سالمونلا.. 10

1-4-2) زیرتقسیم بندی سرووارهای سالمونلا.. 12

1-5) غنی سازی و جداسازی سالمونلا.. 12

1-6) بیماریزایی سالمونلا.. 15

1-6-1) محصولات باکتریایی موثر در ویرولانس… 15

1-6-1-1) انواع آنتی ژن در سالمونلا.. 15

1-6-1-2) اندوتوکسین.. 16

1-6-1-3) انتروتوکسین.. 17

1-6-2) سیکل عفونت سالمونلا.. 17

1-6-2-1) انتریت.. 17

1-6-2-2) تب روده ای یا تیفوئید. 18

1-7) اپیدمیولوژی سالمونلا.. 19

1-8) تشخیص آزمایشگاهی سالمونلا.. 21

1-9) درمان. 23

1-10) پیشگیری و کنترل. 23

1-11) اهمیت تایپینگ سالمونلا.. 24

1-12) تایپینگ مولکولی.. 25

1-12-1)  برخی از روش های تایپینگ مورد استفاده در بررسیهای اپیدمیولوژیک… 25

1-12-1-1) اصول و مبانی روش MLVA.. 28

1-12-1-1-1)  اصطلاحات و واژه ها در MLVA.. 33

1-12-1-1-2)  مزایا و معایب MLVA.. 34

1-13) اهداف تحقیق. 41

1-13-1) هدف کلی.. 41

1-13-2) اهداف جزئی.. 41

1-13-3) اهداف کاربردی.. 41

1-14) فرضیه های تحقیق. 41

1-15) سؤالات.. 41

1-16) واژه نامه ها و اصطلاحات فنی و اصطلاحات اختصاری.. 42

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده

2-) مروری بر تحقیقات انجام شده….……….…………………………………………………………………. 43

فصل سوم: مواد و روش‌ها

3-1) مواد و تجهیزات مورد استفاده جهت جداسازی، تشخیص و ژنوتایپینگ… 50

3-1-1)  دستگاه ها و وسایل مورد نیاز. 50

3-1-2) مواد مصرفی مورد نیاز. 51

3-1-3) محیط های کشت مورد استفاده 52

3-1-4) ترکیبات و محلول های مورد استفاده و فرمول ساخت آن ها 53

3-2) روش مطالعه و اجرای تحقیق. 54

3-2-1) نوع مطالعه. 54

3-2-2) جامعه‌ مورد مطالعه و حجم نمونه. 54

3-3) کشت، جداسازی و تعیین هویت ایزوله های سالمونلا.. 54

3-4)  استخراج ژنوم باکتریایی.. 55

3-5) انجام آزمایشات مولکولی.. 56

3-5-1) پرایمرها 56

3-5-2) رقیق سازی پرایمر. 57

3-6)  ژنوتیپ بندی ایزوله های سالمونلا با استفاده از روش MLVA.. 57

3-6-1)  انجام آزمایش PCR جهت تکثیر لوکوس های VNTR.. 57

3-6-2)  الکتروفورز. 59

3-6-3) رنگ آمیزی و تهیه تصویر. 60

3-6-4) روش محاسبه اندازه و تعداد تکرارهای VNTR.. 61

3-6-5)  تجزیه و تحلیل داده های VNTR.. 61

فصل چهارم: بحث و نتایج

4-1)جمع آوری نمونه ها 63

4-2) کشت، جداسازی و تعیین هویت ایزوله های سالمونلا.. 63

4-3) استخراج ژنوم باکتریایی.. 64

4-4) بهینه سازی دمای (اتصال)Annealing مراحل انجام PCR.. 64

4-5) نتایج PCR لوکوس های VNTR.. 65

4-6) نتایج الکتروفورز. 65

4-6-1) نتایج حاصل از انجام الکتروفورز در لوکوس SENTR2. 66

4-6-2) نتایج حاصل از انجام الکتروفورز در لوکوس SENTR3. 67

4-6-3) نتایج حاصل از انجام الکتروفورز در لوکوس SE4. 68

4-6-4) نتایج حاصل از انجام الکتروفورز در لوکوس SE6. 69

4-6-5) نتایج حاصل از انجام الکتروفورز در لوکوس SE7. 70

4-6-6) نتایج حاصل از انجام الکتروفورز در لوکوس SE8. 71

4-6-7) نتایج حاصل از انجام الکتروفورز در لوکوس SE10. 72

4-6-7) نتایج حاصل از انجام الکتروفورز در لوکوس ENTR6. 73

4-7) برآورد تعداد تکرارهای VNTR.. 73

4-8) میزان تنوع آللهای VNTR.. 76

4-9) تحلیل داده های حاصل از تعداد تکراهای VNTR.. 76

فصل پنجم: نتیجه‌گیری

5 ) نتیجه گیری …………………………………………………………………………………….………………81

پیشنهادات.. 88

فهرست منابع فارسی.. 89

فهرست منابع انگلیسی.. 91

فهرست منابع اینترنتی.. 94

 

جداول

جدول 1-1: خصوصیات بیوشیمیایی سالمونلا………………………………………………………………………..8

جدول 3-1: نام لوکوس، پرایمرهای اختصاصی و اندازه تکرار هر لوکوس VNTR………………………..56

جدول 3-2: مقادیر مورد نیاز جهت انجام واکنش‏های PCR برای تکثیر لوکوس های VNTR………… 58

جدول3-3: برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس‌های VNTR …………………………… 59

جدول 4-1: تعداد تکرارهای لوکوس­های VNTR در هر سویه………………………………………………. 74

فهرست تصاویر

تصویر 1-1: تصویر شماتیک از توالی‌های تکرار شونده (VNTR)…………………………………………… 29

تصویر 1-2: مکانیسم Replication Slippage  . شکل A بیانگر backward replication slippage و شکل B بیانگر Forward replication slippage است………………………………….. 30

تصویر 1-3: پروفایل آللی سویه­ی1………………………………………………………………………………….. 33

تصویر 1-4: تصویری شماتیک از آنالیز MLVA با استفاده از الگوریتم MST……………………………. 34

تصویر1-5: تصویر شماتیک از مراحل انجام MLVA………………………………………………………….. 39

تصویر 4-1: تصویری از ژل الکتروفورز محصولات VNTR…………………………………………………. 64

تصویر4-2 : نتایج حاصل از انجام الکتروفورز در لوکوس SENTR2………………………………………. 66

تصویر4-3 : نتایج حاصل از انجام الکتروفورز در لوکوس SENTR3………………………………………. 67

تصویر4-4 : نتایج حاصل از انجام الکتروفورز در لوکوس SE4……………………………………………….. 68

تصویر4-5 : نتایج حاصل از انجام الکتروفورز در لوکوس SE6……………………………………………….. 69

تصویر4-6 : نتایج حاصل از انجام الکتروفورز در لوکوس SE7……………………………………………….. 70

تصویر4-7 : نتایج حاصل از انجام الکتروفورز در لوکوس SE8……………………………………………….. 71

تصویر4-8 : نتایج حاصل از انجام الکتروفورز در لوکوس SE10…………………………………………….. 72

تصویر4-9 : نتایج حاصل از انجام الکتروفورز در لوکوس ENTR6…………………………………………. 73

تصویر4-10: دندروگرام سویه­ها با روشNJ………………………………………………………………………. 76

تصویر 4-11: دندروگرام سویه­ها با روش UPGMA………………………………………………………….. 77

تصویر4-12: ارتباط سویه‌ها بر اساس آنالیز MST و بر مبنای معیار SLV…………………………………. 78

تصویر 4-13: ارتباط سویه‌ها بر اساس آنالیز MST و بر مبنای معیار DLV……………………………….. 79

تصویر 4-14: ارتباط سویه‌ها بر اساس آنالیز MST و شماره نمونه‌ها………………………………………… 80