همسانه سازی ژن PDIمخمریYCL043C(پروتئین دی سولفیدایزومراز) جهت بیان درمخمرمتیلوتروفPichiapastoris

عنوان                                      فهرست مطالب                                        صفحه

 خلاصه فارسی…………………………………………………………………………………………………1

 مقدمه……………………………………………………………………………………………………….. 2

 

 

فصل اول:کلیات

 

1-1- تولید آنتی بادی های درمان…………………………………………………………………………………………………7

1-2- scFv و مزایای آن بر آنتی بادی…………………………………………………………………………………………..8

1-3- سیستم های بیانی تولید scFv……………………………………………………………………  11

1-4- آنتی بادی بر علیه مارکرCD22…………………………………………………………………… 12

1-5-  انواع روش های بهینه سازی برای افزایش بیان پروتئین های نوترکیب………………………….. 15

1-6-  ساختار ژن PDIساکارومایسس سرویزیه…………………………………………………………..17

 1-7-   وکتور های بیانی…………………………………………………………………………………..20

1-8-  وکتور های بیانی مورد استفاده در Pichai pastoris………………………………………….. 20

فصل دوم: مروری برمتون گذشته

 

 

2-1- پیشینه و اهمیت بیماری سرطان……………………………………………………………………23

2-2- اهمیت استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال در تشخیص و درمان بیماریها……………………….26

2-3- اهمیت scFv در تشخیص و درمان ………………………………………………………………..27

2-4- سیستمهای بیانی scFv…………………………………………………………………………….29

2-6- انواع روش های بهینه سازی برای افزایش بیان پروتئین های نوترکیب……………………………..31

فصل سوم: مواد و روشها

 

 

 

3-1- لیست کامل مواداستفاده شده………………………………………………………………………..36

3-2- دستگاه های مورد استفاده…………………………………………………………………………..38

 

	الف

3-3-پايگاه هاي اطلاعاتي ونرم افزارهاي بيوانفورماتيك …………………………………………………..38

3-4-  طرز تهیه محلول ها و بافرها………………………………………………………………………..39

3-4-1- بافرهای مخصوص الکتروفورز……………………………………………………………………..39

3-4-1-1- بافر الکتروفورز تریس – اسید استیک (TAE 50x)………………………………………….39

3-4-1-2- محلول اتیدیوم برماید………………………………………………………………………….39

3-4-2- بافرهای مخصوص تخلیص پلاسمید………………………………………………………………39

3-4-2-1- محلول P1……………………………………………………………………………………..39

3-4-2-2- محلولP2………………………………………………………………………………………39

3-4-2-3- محلو………………………………………………………………………………..N………….. 39

3-4-2-4- محلولNSS …………………………………………………………………………………………………………………………… 39

3-4-3- بافر مخصوص ترانسفورماسیون باکتری….………………………………………………………..40

3-4-3-1- محلول کلسیم کلراید…………………………………………………………………………..40

3-5- طرز تهیه ی آنتی بیوتیک­ها…………………………………………………………………………40

3-5-1- تتراسیکلین……………………………………………………………………………………….40

3-5-2- آمپی سیلین………………………………………………………………………………………40

3-6- آماده سازی محیط های کشت……………………………………………………………………….40

3-6-1- محیط کشت LBمایع……….…………………………………………………………………….40

3-6-2- محیط کشت LB – AMP – IPTG – XGAL جامد………………………………………40

3-6-3- محیط کشت LB آگار……………………………………………………………………………40

3-6-4-  محیط کشت YPDمایع……………………………………………………………………………………………………………. 40

3-7- وکتورهای مورد استفاده……………………………………………………………………………..41

3-7-1- پلاسمید pGEM-Teasy  …………………………………………………………………. . 41

  3-7-2- پلاسمید pHILD-2  ……………………………………………………………………………41

3-8- روش های عمومی……………………………………………………………………………………42

3-8-1-الکتروفورز قطعات DNA در ژل آگاروز…………………………………………………………..42

3-9- كشت سلول………………………………………………………………………………………….43

ب

3-9-1- نوع سلولها…………………………………………………………………………………………43

3-9-1- روش كشت سلول…………………………………………………………………………………43

 3-10- استخراج DNAاز رده سلول……..……………Saccharomyces cerevisiae…………44

3-10-1- مواد موردنياز…………………………………………………………………………………….44

3-10-2- روش كار…………………………………………………………………………….. ………………44

3-11- پاکسازیDNAاستخراج شده از Saccharomyces cerevisiae   ……………………………….46

3-11-1- مواد لازم برای تخلیص DNAاستخراج شده ازSaccharomyces cerevisiae .. ………46

3-11-2- روش کار  ………………………………………………………………………………………..46

3-12- تكثيرژن PDI… ……………………………………………………………………………………46

3-12-1- توالی ژن   PDI…………………………………………………………………………………46

3-12-2- طراحی پرایمر ها………………………………………………………………………………..47

3-12-3- واکنش زنجیره ای پلی مراز((PCR………………………………………………………….47

3-12-4- انجامPCRباExpand Long Template PCR……………………………………………48

3-12-4-1- مواد لازم………………………………………………………………………………………… 48

3-12-4-2- بر نامه واکنش PCR…………………………………………………………………………… 49

3-12-5- تخلیص محصول PCR………………………………………………………………………… 49

2-12-5-1- مواد مورد نیاز……………………………………………………………………………………..49

3-12-5-2 – روشكار……………………………………………………………………………………….49

3-13- مراحل همسانه سازی………………………………………………………………………………50

3-13-1- همسانه سازی محصولات PCR در وکتور pGEM-T Easy. ……………………………….50

3-13-2- واکنش اتصال(Ligation Reaction). ………………………………………………………51

3-13-3- بررسی وضعیت اتصال…………………………………………………………………………..51

3-13-4-  تراریختی در باکتر…………………………………………………………………………………..52

3-13-5- تست بررسی سریع پلاسمیدها(Quick check).……………………………………………..54

3-13-6- تأييدكلون هاي حاصل باروش کلنی  PCR…………………………………………………….54

3-13-6-1- واكنش PCR برايتأييدكلونهايPDIpGEM-T Easy -…………………………………55

3-13-6-2- برنامه PCR. ………………………………………………………………………………..56

3-13-7- تاييدكلونينگ با استفاده ازروش استخراج پلاسميد……………………………………………..56

3-13-7-1- استخراج پلاسمید با کیت Mini prep…………………………………………………… 56

3-13-8- بررسی وکتور با روش هضم آنزی……………………………………………………………….57

3-13-9- تأييدكلونهاي حاصل باروش تعيين توالي قطعه كلون شده…………………………………….58

پ

3-13-10- استخراج پلاسميد به صورتLarge Scale ………………………………………………….58

3-13-10-1- موادلازم…………………………………………………………………………………….59

3-13-10-2- روشكار………………………………………………………………………………………59

3-14- انتقال وکتور بیانی pHILD-2 به Top10F‘E.coli.…………………………………………..60

3-14-1- استخراج پلاسمید با کیت Mini prep. ……………………………………………………...60

3-14-2- بررسی وکتور با روش هضم آنزیمی……………………………………………………………..62

3-14-3- استخراج پلاسميد درمقياسLarge scale. …………………………………………………..62

3-15- مراحل طراحی سازه نهایی…………………………………………………………………………62

3-15-1- برش آنزیمی به وسیله EcoRI. ……………………………………………………………….62

3-15-2- جداسازی DNA از ژل آگارز……...…………………………………………………………..63

3-15-3- استخراج DNA از ژل آگارز توسط کیت Qiagen. …………………………………………...63

3-15-4- واكنش اتصال ( Ligation ) بين وكتورpHIL-D2 خطي شده وژنPDI. ………………….64

3-15-5 -تهيه سلولهاي پذيرا وترانسفورماسيون…………………………………………………………..65

3-15-6- تاييدكلونينگ ژنPDI دروكتوربيانيpHIL-D2 به روش کلنیPCR ………………………….65

3-15-7- استخراج پلاسمید با کیت Mini prep…………………………..…………………………...65

3-15-8- بررسی وکتورها با روش هضم آنزیمی…………………………………………………………...65

3-15-9- استخراج پلازمید به صورت Large Scale…… …………………………………………….66

 

 

فصل چهارم: نتایج

 

 

4-1- استخراج DNA ژنومیک از مخمر(BY 4742)Saccharomyces cerevisiae.……………..68

4-2- تکثیر ژن PDI با استفاده از واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR).………………………………..68

4-3- کلونینگ محصول PCR در T-Vector……………………………….……………………………….68

4-4- تائید کلونینگ ژن PDIدرT-Vector با روش Colony PCR………………………………….71

4-5-  تایید کلون­های به دست آمده از طریق هضم آنزیمی(Restriction sitemapping). …………72

4-6-  تعیین توالی ژن PDI در کلونینگ وکتور…………………………………………………………..73

4-7- ترانسفورم کردن وکتور بیانی pHIL-D2 داخل E.coliTop10F’……………………………….75

4-8- تایید کلون­های به دست آمده از طریق هضم آنزیمی………………………………………………..76

4-9- تهیه سازه اصلی PDI pHIL-D2 / . ……………………………………………………………..78

ت

4-10- تائید کلونینگ ژن PDIدر وکتور بیانی pHIL-D2 با استفاده از روشکلنی PCR………………80

3-11- تائید کلونینگ ژن PDIو نیز راستای ژن کلون شده در وکتور بیانی pHIL-D2 با استفاده از روش هضم آنزیمی(Digestion)…………………………………………………………………………………81

فصل پنجم: بحث وپیشنهادات

5-1- آنتی بادی های مونوکلونال و اهمیت آنها در تشخیص و درمان بیماری ها………………………….87

5-2-  اهمیت scFv در تشخیص و درمان……………………………………………………………….88

3-5-  سیستم های بیانیscFv………………………………………………………………………..88

5-4-  انواع روش های بهینه سازی برای افزایش بیان پروتئین های نوترکیب……………………………90

5-5- نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………92

5-6-  مسیر آینده پروژه……………………………………………………………………………….93

 

منابع………………………………………………………………………………………………………94

خلاصه انگلیسی………………………………………………………………………………………..101

 

	ث

عنوان                                                فهرست جداول                                                   صفحه

 

 

جدول 1-1- وکتور های بیانی مورد استفاده در Pichia pastoris ……………………………………..20

جدول3- 1- لیست مواد و کیت های مورد استفاده در این مطالعه…………………………………………36

جدول 3-2- دستگاه های مورد استفاده…………………………………………………………………….43

جدول 3-3– اجزای ژل آگارز 1 درصد……………………………………………………………………..43

جدول3-4- اجزای Loading bufferبرایDNA……………………………………………………….43

جدول3-5- لیست مواد حاضر در واکنش PCR به حجم 25 ماکرولیتر…………………………………..48

جدول 3-6- زمان بندی PCR برای جدا کردن ژنPDI………………………………………………….48

جدول 3-7- زمان بندی PCR برای جدا کردن ژنPDI………………………………………………….49

جدول 3-8- مواد لازم برای واکنش اتصال………………………………………………………………….51

جدول 3-9- اجزای محیط کشت برای کشت سلول های ترانسفورم شده………………………………….53

جدول 3-10 –مواد لازم برای انجام واکنش کلنی PCR…………………………………………………..55

جدول 3-11- زمان بندی PCRبرای جدا کردن کلون های مثبت………………………………………..56

جدول 3-12- مواد لازم برای واکنش هضم آنزیمی………………………………………………………..58

جدول 3-13- مواد لازم برای واکنش هضم آنزیم………………………………………………………….58

جدول 3-14- اجزای محیط کشت برای کشت سلول های ترانسفورم شده………………………..………..60

جدول 3-15- مواد لازم جهت هضم آنزیمی………………………………………………………………..61

جدول 3-16- مواد لازم جهت هضم آنزیمی………………………………………………………………..61

جدول 3-17- موادلازم جهت برش سازهTV-PDIباآنزيمEcoRI………………………………………..62

جدول 3-18– موادلازم جهت برش وكتورpHILD-2 باآنزيمEcoRI…………………………………..63

جدول 3-19- مواد لازم جهت انجام واکنش اتصال ( Ligation ).……………………………………….64

جدول 3-20-مواد لازم جهت انجام کلنی PCR. …………………………………………………………65

جدول 3-21- مواد لازم جهت هضم آنزیمی………………………………………………………………..66

جدول 3-22- مواد لازم جهت هضم آنزیمی………………………………………………………………..66

 

	ج

عنوان                                         فهرست اشکال                                                          صفحه

 

شکل 1-1 – نمایی شماتیک از پلاسمید بیانی pHILD- 2. …………………………………………….21

شکل3-1- نقشه پلاسمیدpGEM-Teasy و جایگاه­های برشی آن……………………………………….41

شکل 3-2-  نقشه پلاسمید pHILD-2  و جایگاه های برشی آن………………………………………..42

شکل4-1-  DNAژنومیک استخراج شده از Saccharomyces cerevisiae روی ژل آگارز 1%……68

 

شکل4-2– نتیجه PCRژن PDIبا استفاده از DNAژنومیک مخمرSacharomyces cerevisiaeو آنزیم TaqDNAPolymerase………………………………………………………………………………..69

شکل 4-3-نتیجه PCRژنPDIبا استفاده از DNAژنومیک مخمرSacharomycescerevisiaeو آنزیمpfu DNAPolymerase………………………………………………………………………………………69

شکل 4-4- نقشه وکتورpGEM-T Easy………………………………………………………………..70

شکل 4-5 – محیط کشت حاوی کلنی های سفید و آبی حاصل از ترانسفورماسیونوکتورpGEM-T Easy حامل ژن PDI به باکتری TOP10F’…………………………………………………………………….71

شکل4-6-1- الکتروفورز محصول Colony PCR بر روی کلون های کشت داده شده حاصل از ترانسفورماسیونوکتورpGEM-T Easyحامل ژن PDI……………………………………………………72

شکل 4-6-2- استخراج پلاسمید از کلنی هایی با کلنی PCR مثبت……………………………………..72

شکل4-6-3- تایید صحت قطعه ژنومی PDI با استفاده از برش آنزیمی………………………………….73

شکل4-7-1- تعیین توالی ژن PDI در کلونینگ وکتور……………………………………………………74

شکل 4-7-2- تعیین توالی ژن PDI در کلونینگ وکتور…………………………………………………..75

شکل 4-8 -محیط کشت حاوی کلنی حاصل از ترانسفورماسیون پلاسمید بیانی pHIL-D2به باکتری TOP10F’………………………………………………………………………………………………….76

شکل  4-9-نمای شماتیک از وکتور بیانی pHIL-D2 همراه با سایت های برشی آن ………………….……77

شکل4-10- هضم آنزیمی وکتورpHIL-D2 توسط آنزیم هایEcoR1وSalI…………………………..77

شکل 4-11- نمای شماتیک از سازه ژنیPDIpHIL-D2 /……………………………………………..79

شکل4-12- هضم آنزیمی وکتور بیانی pHIL-D2و TV-PDIتوسط آنزیم محدود کننده EcoR1……79

شکل4-13- محصول استخراج ژنPDI و نیز وکتور خطی شده pHIL-D2 از ژل آگارز %1…………….80

شکل 4-14- کلنی PCRروی کلنی های مثبت کشت باکتری E.coliTop10 F‘که وکتور بیانی pHIL-D2/PDI به آن ترانسفورم شده است…………………………………………………………………….. 80

	چ

 

شکل4-15– نمای شماتیک از سازه ی ژنیPDI/ pHIL-D2 زمانی که ژن PDIبا جهت صحیح در پلاسمید بیانی قرار بگیرد……………………………………………………………………………………81

شکل 4-16- نمای شماتیک از سازه ژنیPDI/ pHIL-D2 زمانی که ژن PDIبا جهت غلط داخل پلاسمید بیانی pHIL-D2 قرار می گیرد……………………………………………………………………………82

شکل 4-17-اندازه قطعات حاصل از برش با آنزیم های مختلف هنگامی که ژن PDIبا جهت درست داخل پلاسمید  بیانی قرار می گیرد…………………………………………………………………………………83

شکل 4-18 – اندازه قطعات حاصل از برش با آنزیم های مختلف هنگامی که ژن PDIبا جهت نا درست داخل پلاسمید بیانی pHIL-D2 قرار می گیرد……………………………………………………………………83

شکل4-19- هضم آنزیمی پلاسمید بیانی pHILD- 2 حاوی ژن PDI توسط آنزیم های EcoR1وSacIوSalI………………………………………………….……………………… 83