همسانه سازي cDNA ژن تيوردوکسين h (VvTRXh) از بافت حبه انگور رقم یاقوتی (Vitis vinifera L. cv. Yaquti)

صفحه         

فصل اول: مقدمه و کلیات

1-1- تاريخچه انگور……………………………………………………………………………………………………………………………. 2

1-2- معرفي انگور………………………………………………………………………………………………………………………………. 3

1-3- گياه شناسي انگور ………………………………………………………………………………………………………………………. 3

1-3-1- زيرجنس يوويتيس………………………………………………………………………………………………………………….. 4

1-3-1-1- گونه­هاي آسيايي…………………………………………………………………………………………………………………. 4

1-3-1-2- گونه­هاي آمريكايي………………………………………………………………………………………………………………. 5

1-3-1-3- گونه­هاي اروپايي ……………………………………………………………………………………………………………….. 5

1-3-2- زيرجنس موسکادينه ……………………………………………………………………………………………………………….. 5

1-4- تقسيم بندي تجاري ارقام انگور…………………………………………………………………………………………………….. 6

1-5- توسعه و توليد…………………………………………………………………………………………………………………………….. 6

1-6- انگورهاي بي­دانه…………………………………………………………………………………………………………………………. 6

1-7- ترکيبات شيميايي موجود در انگور………………………………………………………………………………………………… 7

1-7-1- پلي­فنول­ها……………………………………………………………………………………………………………………………… 7

1-7-2- رسوراترول…………………………………………………………………………………………………………………………….. 7

1-7-3- آنتوسيانين………………………………………………………………………………………………………………………………. 8

1-8- ارزش غذايي انگور……………………………………………………………………………………………………………………… 8

1-8-1- روغن بذر انگور……………………………………………………………………………………………………………………… 9

1-8-2- عصاره انگور………………………………………………………………………………………………………………………….. 9

1-9- تيوردوکسين­ها………………………………………………………………………………………………………………………….. 10

1-10- بیوتیول­ها……………………………………………………………………………………………………………………………….. 13

1-11- سيستم­هاي تيوردوکسيني در موجودات زنده………………………………………………………………………………. 14

 1-12- کشف تيوردوکسين در گياهان…………………………………………………………………………………………………. 14

1-13- سيستم­هاي تيوردوکسين­هاي گياهي………………………………………………………………………………………….. 16

1-13-1- سيستم فردوکسين– تيوردوکسين کلروپلاستي………………………………………………………………………… 17

1-13-2- سيستم سيتوسولي تيوردوکسين در گياهان………………………………………………………………………………. 17

1-13-3- سيستم تيوردوکسين- گلوتاردوکسين…………………………………………………………………………………….. 18

1-13-4- سيستم تيوردوکسين- ريبونوکلئوتيد ردوکتاز…………………………………………………………………………… 18

1-13-5- سيستم NADH- تيوردوکسين و جوانه زني بذر……………………………………………………………………… 19

1-14- تيوردوکسين­هاي سازواره­هاي فتوسنتزي…………………………………………………………………………………….. 20

1-14-1- توالي­ها و تكامل…………………………………………………………………………………………………………………. 20

1-14-2- ساختمان ثانويه…………………………………………………………………………………………………………………… 20

1-14-3- ساختار سه بعدي………………………………………………………………………………………………………………… 21

1-14-4- جايگاه فعال تيوردوکسين…………………………………………………………………………………………………….. 21

1-15- ساختار درخت فيلوژنيک تيوردوکسين هاي گياهي……………………………………………………………………… 22

1-16- عملکردهاي فيزيولوژيک تیوردوکسین­ها در سازواره­های مختلف………………………………………………….. 23

1-16-1- سازواره­هاي غير فتوسنتزي…………………………………………………………………………………………………… 23

1-16-2- سازواره­هاي فتوسنتزي…………………………………………………………………………………………………………. 24

1-16-2-1- سيستم­هاي کلروپلاستي…………………………………………………………………………………………………… 24

1-16-2-2- سيستم­هاي غير کلروپلاستي……………………………………………………………………………………………… 25

1-17- سيستم­هاي کاهشي تيوردوکسين……………………………………………………………………………………………….. 26

1-17-1- NADPH- تيوردوکسين ردوکتاز…………………………………………………………………………………………… 26

1-17-2- فردوکسين- تيوردوکسين ردوکتاز (FTR)………………………………………………………………………………. 26

1-18- آنزيم­هاي هدف مختلف مرتبط با سيستم کاهشي تيوردوکسين………………………………………………………. 27

 1-19- زیرگروه­های مختلف ژن تیوردوکسین نوع h………………………………………………………………………………27

فصل دوم: بررسي منابع 

2-1- پروتئین­های تیوردوکسین…………………………………………………………………………………………………………… 29

2-2 تحقیقات ژنومیکس……………………………………………………………………………………………………………………… 29

2-3 تحقیقات پروتئومیکس…………………………………………………………………………………………………………………. 35

 

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1- مواد گياهي و نمونه برداري………………………………………………………………………………………………………… 46

3-2- استخراج RNA کل……………………………………………………………………………………………………………………. 46

3-2-1- ضدعفوني وسائل و محلول­هاي به­کار گرفته شده در مراحل مختلف استخراج RNA كل……………….. 46

3-3- تخمين كميت و کيفيت RNA كل استخراج………………………………………………………………………………….. 49

3-3-1- اسپکتروفتومتري RNA كل استخراجي…………………………………………………………………………………….. 49

3-3-2- الكتروفورز ژل آگارز- فرم آلدهید 2/1 درصد…………………………………………………………………………… 50

3-4- واکنش نسخه برداري معکوس و ساخت رشته اول cDNA…………………………………………………………….. 52

3-5- الکتروفورز محصول واکنش نسخه برداري معکوس……………………………………………………………………….. 54

3-6- جداسازي ژن VvTrxh با استفاده از واكنش زنجيره­اي پليمراز نسخه برداري معکوس (PCR)………………..56

3-6-1- طراحي آغازگرهاي اختصاصي ژن…………………………………………………………………………………………… 56

3-6-2- نحوه انجام PCR اختصاصي…………………………………………………………………………………………………… 57

3-6-3- PCR اختصاصي با استفاده از DNA پليمراز pfu……………………………………………………………………….. 58

3-6-4- PCR اختصاصي با استفاده از DNA پليمراز Taq………………………………………………………………………. 59

3-7- بررسي محصولات PCR……………………………………………………………………………………………………………. 60

3-7-1- بررسي محصولات PCR بوسيله الكتروفورز ژل آگارز……………………………………………………………….. 60

3-7-2- بررسي محصولات PCR بوسيله هضم آنزيمي………………………………………………………………………….. 60

3-8- خالص­سازي محصولات PCR از ژل آگارز………………………………………………………………………………….. 62

3-9- هضم آنزيمي محصولات PCR خالص­سازي شده از ژل………………………………………………………………… 63

3-10- هضم آنزيمي ناقل پلاسميدي و حذف فسفر انتهاي ‘5…………………………………………………………………. 65

3-11- واکنش اتصال ژن  VvTrxh به ناقل pUC19……………………………………………………………………………….. 69

3-12- رشد و تكثير باكتري­ E. coli و اگروباکتريوم……………………………………………………………………………….. 70

3-13- محيط­هاي كشت باکتريايي……………………………………………………………………………………………………….. 71

3-13-1- محيط كشت LB…………………………………………………………………………………………………………………. 71

3-13-2- محيط كشت SOB حاوي آگار، آمپي­سيلين، X-Gal و IPTG جهت انجام آزمون سفيد- آبي………… 72

3-13-3- محيط كشت SOB حاوي آگار، کانامايسين و محيط كشت SOB حاوي آگار، کانامايسين و ريفامپيسين…………………………………………………………………………………………………………………………………………..73

3-13-4- محيط كشت SOC………………………………………………………………………………………………………………. 73

3-14- ذخيره­سازي باكتري­هاي رشد يافته در محيط كشت مايع………………………………………………………………. 74

3-15- مستعد سازي سلول­هاي E. coli با استفاده از كلريد كلسيم…………………………………………………………… 74

3-16- تهيه ذخيره سلول­هاي مستعد…………………………………………………………………………………………………….. 76

3-17- انتقال پلاسميد حاوي ژن به سلول­هاي مستعد E. coli…………………………………………………………………. 77

3-17-1- تخمين بازده سلول­هاي تراريخت با استفاده از كنترل مثبت……………………………………………………….. 78

3-18- آزمون سريع كلوني­هاي نوتركيب بوسيله PCR……………………………………………………………………………. 78

3-19- استخراج پلاسميد با استفاده از روش تحليل قليايي و SDS………………………………………………………….. 79

3-20- بررسي كلوني­هاي نوتركيب……………………………………………………………………………………………………… 82

3-21- تعيين جهت ژن همسانه سازي شده در ناقل pUC19…………………………………………………………………… 82

3-21-1- هضم آنزيمي ناقل نوترکيب………………………………………………………………………………………………….. 82

3-21-2- توالي­يابي DNA……………………………………………………………………………………………………………………84

3-22- جداسازي ژن  VvTrxh همسانه سازی شده از ناقل نوترکیب  pUC19‌با استفاده از واكنش­هاي

زنجيره پليمراز (PCR)…………………………………………………………………………………………………………………………. 84

3-23- هضم آنزيمي ناقل دوگانه pBI121 و حذف فسفر انتهاي ′5…………………………………………………………. 86

3-24- اتصال ژن VvTrxh به ناقل دوگانه pBI121………………………………………………………………………………… 87

3-25- انتقال ناقل نوترکيب pBI121 به سلول هاي مستعد  E. coli…………………………………………………………. 87

3-26- بررسي کلوني هاي نوترکيب E. coli…………………………………………………………………………………………. 88

3-27- تعیین جهت ژن همسانه­سازي شده در ناقل pBI121……………………………………………………………………. 88

3-28- تهيه سلول هاي مستعد اگروباکتريوم با استفاده از کلريد کلسيم……………………………………………………… 89

3-29- انتقال ناقل نوترکيب pBI121 به سلول هاي مستعد اگروباکتريوم…………………………………………………… 90

3-30- بررسي کلوني­هاي نوترکيب اگروباکتريوم…………………………………………………………………………………… 92

3-30-1- استخراج پلاسميد از اگروباکتریوم با استفاده از محلول قليايي و SDS………………………………………… 92

3-30-2 تعیین جهت ژن همسانه­سازي شده در ناقل pBI121 پس از استخراج از اگروباکتریوم……………………. 95

فصل چهارم: نتايج و بحث

4-1- استخراج RNA كل……………………………………………………………………………………………………………………. 97

4-2- واكنش نسخه برداري معكوس (RT) و سنتز DNA مكمل (cDNA)……………………………………………… 102

4-3- واكنش زنجيره اي پليمراز نسخه برداري معكوس (PCR) استاندارد……………………………………………….. 104

4-4- خالص سازي محصول PCR از ژل آگارز…………………………………………………………………………………… 106

4-5- نتايج هضم آنزيمی………………………………………………………………………………………………………………….. 108

4-5-1- تاييد محصول PCR با استفاده از هضم آنزيمي……………………………………………………………………….. 108

4-5-2- هضم آنزیمي ژن و ناقل پلاسميدي pUC19 توسط آنزيم برشي KpnI……………………………………….. 108

4-6- واكنش اتصال بين ژن VvTrxh و ناقل پلاسميدي pUC19……………………………………………………………. 110

4-7- انتقال مولكول DNA نوتركيب به درون سلول مستعد E. coli……………………………………………………….. 112

4-8- تاييد كلوني هاي نوتركيب………………………………………………………………………………………………………… 116

4-8-1- شناسايي سريع كلوني هاي نوتركيب……………………………………………………………………………………… 116

4-8-2- استخراج پلاسميدهاي نوتركيب از كلوني هاي تراريخته به روش تحليل قليايي با   SDS ……………. 118

4-8-3- تاييد كلوني هاي نوتركيب بوسيله واكنش زنجيره اي پليمراز (PCR)…………………………………………. 119

4-8-4- تاييد كلوني هاي نوتركيب با استفاده از هضم آنزيمي………………………………………………………………. 119

4-9- تعيين جهت ژن VvTrxh همسانه سازي شده با استفاده از هضم آنزيمي…………………………………………..120

4-10- توالي يابي DNA ژن هاي همسانه سازي شده…………………………………………………………………………… 122

4-11- نتايج بررسي هاي ترتيب توالي و روابط فيلوژنتيکي…………………………………………………………………… 122

4-12- جداسازي ژن VvTrxh همسانه سازی شده از ناقل نوترکیب  pUC19‌ با استفاده از واكنش­هاي

زنجيره­اي پليمراز(PCR)……………………………………………………………………………………………………………………. 130

4-13- هضم آنزيمي ناقل دوگانه pBI121 و حذف فسفر انتهایی ′5………………………………………………………. 131

4-14- واكنش اتصال بين ژن VvTrxh و ناقل دوگانه pBI121………………………………………………………….. 132

4-15- انتقال ناقل نوتركيب pBI121 به سلول هاي مستعد E. coli………………………………………………………… 132

4-16- تاييد كلوني هاي نوتركيب E. coli…………………………………………………………………………………………… 133

4-16-1- تاييد کلوني نوترکيب با استفاده از هضم آنزيمي……………………………………………………………………. 133

4-16-2- تاييد کلوني نوترکيب بوسيله واکنش زنجيره اي پليمراز (PCR)………………………………………………. 134

4-17- تعیین جهت ژن همسانه­سازي شده در ناقل pBI121…………………………………………………………………. 135

4-18- انتقال ناقل نوترکيب pBI121 به سلول هاي مستعد اگروباکتريوم…………………………………………………. 137

4-19- تاييد كلوني هاي نوتركيب اگروباکتريوم…………………………………………………………………………………… 138

4-20- تعیین جهت ژن همسانه­سازي شده پس از استخراج ناقل نوترکیب pBI121 از اگرو باکتریوم………….. 139

فصل پنجم: جمع بندي و پيشنهادها

5-1- جمع بندی……………………………………………………………………………………………………………………………… 142

5-2- پيشنهادها……………………………………………………………………………………………………………………………….. 144

منابع……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 146

پيوست­ها………………………………………………………………………………………………………………………………………… 162

پیوست 1- اطلاعات بدست آمده در رابطه با ژن VvTrxh موجود در بانک ژن NCBI با شماره دستیابی AM430243 جهت طراحی پرایمر و همچنین مقایسه ترتیب توالی نوکلئوتیدی و پروتئینی ژن VvTrxh همسانه سازی شده با آن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….162

پیوست 2- محل قرارگیری آغازگرهای طراحی شده با مکان برشی آنزیم KpnI روی ژن VvTrxh موجود در بانک ژن NCBI با شماره دستیابی AM430243………………………………………………………………………………………………..163

پیوست 3- محل قرارگیری آغازگرهای طراحی شده با مکان برشی آنزیم BamHI روی ژن  VvTrxhموجود در بانک ژن NCBI با شماره دستیابی AM430243………………………………………………………………………………………..163

پیوست 4- تجزیه و تحلیل مکان­های برشی ژن تیوردوکسین h موجود در بانک ژن NCBI با شماره دستیابی AM430243. با استفاده از نرم­افزار آن لاین Restrictionmapper V.3  (www.Restrictionmapper.com)……………..164

پیوست 5- نقشه ژنتیکی ناقل پلاسمیدی pUC19 به همراه توالی پلی لینکر آن (www.fermentase.com)………..165

پیوست 6- نقشه ژنتیکی ناقل دوگانه pBI121 (www.fermentase.com)………………………………………………….165

پیوست 7- ترتیب توالی نوکلئوتیدی و پروتئینی ژن VvTrxh همسانه سازی شده با ژن موجود در بانک ژن NCBI با استفاده از نرم افزار (http://clustalW.genome.ad.jp) ClustalW……………………………………………………………166

پیوست 8- ژن  ثبت شده  VvTrxhدر بانک ژن NCBI و با شماره دستیابی HM622264. این ژن توسط نگارنده و همکاران (2010) از بافت حبه گیاه انگور و رقم Yaquti استخراج، توالی یابی و به بانک ژن NCBI معرفی شده است……………………………………………………………………………………………………………..167

 

 

 

 

فهرست جداول

    عنوان                                                                                                                صفحه                    

 

جدول (1-1) ویژگی­ها و خصوصیات زیرگروه­های I، II و III از تیوردوکسین­های گروه h…………………………..27

جدول (3-1) مقدار و غلظت ترکيبات واکنش سنتز cDNA……………………………………………………………………. 54

جدول (3-2) مشخصات آغازگرهاي استفاده شده جهت PCR اختصاصي ژن…………………………………………… 57

جدول (3-3) مقدار و غلظت تركيبات PCR اختصاصي با استفاده از DNA پليمراز pfu……………………………… 59

جدول (3-4) چرخه حرارتي PCR اختصاصي با استفاده از DNA پليمراز pfu………………………………………….. 59

جدول (3-5) مقدار و غلظت تركيبات PCR اختصاصي با استفاده از DNA پليمراز Taq……………………………. 60

جدول (3-6) مقدار و غلظت ترکيبات هضم آنزيمي محصولات PCR……………………………………………………… 62

جدول (3-7) مقدار و غلظت تركيبات هضم آنزيمي ژن VvTrxh…………………………………………………………….. 64

جدول (3-8) مقدار و غلظت ترکيبات واکنش اتصال……………………………………………………………………………… 70

جدول (3-9) محيط كشت LB…………………………………………………………………………………………………………… 72

جدول (3-10) محيط كشت SOB………………………………………………………………………………………………………. 73

جدول (3-11) مقدار و غلظت ترکيبات هضم آنزيمي به منظور تعيين جهت ژن همسانه سازي شده بر روي ناقل پلاسميدي pUC19………………………………………………………………………………………………………………………………83

جدول (3- 12) مشخصات آغازگرهاي استفاده شده جهت جداسازی ژن  VvTrxh توسط PCR اختصاصي از

ناقل نوترکیب pUC19 ………………………………………………………………………………………………………………………85        

جدول (3-13) مقدار و غلظت ترکيبات هضم آنزيمي ناقل دوگانه pBI121………………………………………………..86

جدول (4-1) نتايج اسپكتروفتومتري RNA كل استخراجي از بافت هاي مختلف گياه انگور، رقم ياقوتي و مقايسه

آن با روش ياندولينو و همكاران (2004)…………………………………………………………………………………………….. 102

جدول (4-2) نسبت ها و غلظت هاي مختلف ناقل و قطعه DNA در واكنش اتصال………………………………… 112

فهرست شکل ها

عنوان                                                                                                                    صفحه

شکل (1-1) ساختار ثانویه و سه بعدی پروتئین تیوردوکسین به همراه جایگاه فعال آن…………………………………12

شکل (4-1) الکتروفورز RNA کل استخراجي از بافت هاي مختلف روي ژل آگارز- فرم آلدهيد 2/1 درصد.101

شکل (4-2) الکتروفورز cDNA سنتز شده در بافت­هاي مختلف (حبه و برگ) روي ژل آگارز 2/1 درصد….. 103

شکل (4-3) الکتروفورز محصول PCR در بافت هاي مختلف روي ژل آگارز 2/1 درصد…………………………. 106

شکل (4-4) الکتروفورز محصول PCR از بافت حبه، جهت خالص سازي ژن VvTrxh از ژل آگارز 8/0 درصد……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 107

شکل (4-5) الکتروفورز ژن VvTrxh از بافت حبه، پس از خالص سازي از ژل، روي ژل آگارز 2/1 درصد… 107

شکل (4-6) تاييد محصول PCR از بافت حبه با استفاده از هضم آنزيمي و الکتروفورز روي ژل آگارز 7/1 درصد……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 109

شکل (4-7) ايجاد انتهاي چسبان در ژن VvTrxh از بافت حبه با استفاده از هضم آنزيمي با آنزيم محدودکننده KpnI و الکتروفورز روي ژل آگارز 2/1 درصد…………………………………………………………………………………….. 110

شکل (4-8) ايجاد انتهاي چسبان در ناقل پلاسميدي pUC19 با استفاده از هضم آنزيمي با آنزيم محدودکننده KpnI و الکتروفورز روي ژل آگارز 8/0 درصد…………………………………………………………………………………….. 110

شکل (4-9) شناسايي کلوني هاي باکتريايي نوترکيب از بافت حبه با استفاده از آزمون سفيد- آبي…………….. 116

شکل (4-10) آزمون سريع کلوني هاي نوترکيب با استفاده از تکنيک PCR و الکتروفورز روي ژل

 آگارز 2/1 درصد…………………………………………………………………………………………………………………………….. 117

شکل (4-11) الکتروفورز پلاسميدهاي نوترکيب استخراجي از کلون هاي تراريخته روي ژل آگارز 8/0

درصد……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 118

شکل (4-12) تاييد کلوني­هاي نوترکيب با استفاده از تکنيک PCR و الکتروفورز روي ژل آگارز 2/1 درصد……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 119

شکل (4-13) تاييد کلوني­هاي نوترکيب با استفاده از هضم آنزيمي و الکتروفورز روي ژل آگارز 2/1 درصد. 120

شکل (4-14) نتايج حاصل از تعيين جهت ژن همسانه سازي شده با استفاده از هضم آنزيمي با آنزيم­های

برشي Van91I و HindIII و الکتروفورز روي ژل آگارز 5/1 درصد………………………………………………………… 121

شکل (4-15) توالي نوکلئوتيدي ژن VvTrxh  همسانه سازي شده از بافت حبه انگور، رقم یاقوتی…………….. 122 شکل (4-16) توالی پروتئینی ژن VvTrxh همسانه سازی شده از رقم یاقوتی به طول 114 اسید آمینه. موتیف­های ساختاری ویژه پروتئین بصورت ضخیم نشان داده شده­اند………………………………………………………………………..122

شکل (4-17) همردیف سازی پروتئینی ژن VvTrxh همسانه سازی شده با ایزوفرم­های دیگر انگور (زیرگروه I) و گیاهان دیگر با استفاده از نرم افزار ClustalW…………………………………………………………………………………… 125

شکل (4-18) درخت فيلوژنتيکي رسم شده ژن همسانه سازي شده با ساير آيزوفرم­هاي انگور و آيزوفرم­هاي گياهان ذرت، برنج، گندم، سویا، کلزا، توتون، سورگوم، نخود، یونجه، درخت صنوبر، صنوبر سیتکا، اوکالیپتوس، کرچک روغنی، آرابيدوپسيس، نیلوفر صحرایی، چچم، نوروزک، فلفل زینتی، سیب مانگرو،Fagopyrum esculentum ، Citrus sinensis، Capsicum annuum، Solanum berthaultii، Ipomoea batatas و Jatropha curcas، به منظور تعيين زيرگروه ژن­ همسانه سازي شده با استفاده از نرم افزار ClustalW………………………… 128

شکل (4-19) ايجاد انتهاي چسبان در ژن VvTrxh با استفاده از هضم آنزيمي با آنزيم محدودکننده BamHI و الکتروفورز روي ژل آگارز 2/1 درصد…………………………………………………………………………………………………. 131

شکل (4-20) هضم آنزيمي و حذف فسفر انتهای ′5 ناقل دوگانه pBI121 وحشي بترتیب با آنزيم هاي BamHI و آلكالين فسفاتاز روده گوساله (CIP) و الکتروفورز روي ژل آگارز 8/0 درصد……………………………………….. 132

شکل (4-21) تاييد کلوني نوترکيب با استفاده از هضم آنزيمي و الکتروفورز روي ژل آگارز 8/0 درصد…….. 134

شکل (4-22) تاييد کلوني­هاي نوترکيب با استفاده از تکنيک PCR و الکتروفورز روي ژل آگارز 2/1 درصد.. 135

شکل (4-23) تعیین جهت ژن همسانه­سازي شده در ناقل pBI121 با استفاده از ژل آگارز 8/0 درصد……….. 136

شكل (4-24) کلونی­های تراریخته باکتریایی حاوی pBI121 نوترکیب……………………………………………………. 137

شکل (4-25) تاييد کلوني­هاي نوترکيب با استفاده از تکنيک PCR و الکتروفورز روي ژل آگارز 2/1 درصد.. 138

شکل (4-26) تعیین جهت ژن همسانه سازي شده در ناقل pBI121 با استفاده از ژل آگارز 8