%41تخفیف

دانلود پروژه:مقایسه­ خصوصیات سینتیکی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان

تعداد102صفحه در فایل word

گروه مهندسی شیمی

کارشناسی ارشد «M.Sc.»

گرایش: بیوتکنولوژی

مقایسه­ خصوصیات سینتیکی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان

چکیده:

لیپازها یکی از مهمترین آنزیم­ها در سیستم­های بیولوژیکی در صنایع مختلف است. کاربرد لیپاز آزاد به دلیل نیمه عمر کمتر در صنایع مقرون به صرفه نیست. تثبیت آنزیم روی پایه­های مختلف باعث افزایش پایداری، استفاده مکرر، سهولت جداسازی محصول، کنترل بیشتر واکنش و هزینه کمتر می­شود. تثبیت آنزیم غالبا بر روی پایه های متخلخل آلی یا معدنی انجام می­شود اما در سال­های اخیر از انواع نانوذرات به دلیل سطح تماس بالا در واحد حجم استفاده شد. هدف از این مطالعه سنتز نانوذرات کیتوسان و تثبیت آنزیم لیپاز بطریق کووالان با واسطه گلوتارآلدئید روی نانوذره و مقایسه فعالیت و پارامترهای سینتیکی آنزیم آزاد و تثبیت شده می­باشد. ابتدا نانو ذره کیتوسان در آزمایشگاه سنتز و سپس عملیات تثبیت آنزیم بطریق کووالانسی از طریق واکنش بازشیف انجام شد. و با روش­های میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM)، طیف سنجی مادون قرمز (FT-IR) و زتا سایزر مورد بررسی و تأیید قرار گرفت. در مرحله بعد فعالیت آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده به دو روش کیت تشخیصی پارس آزمون و روش استاندارد پارانیتروفنیل پالمیتات (pNPP) اندازه­گیری و پارامترهای سینتیکی Km  و Vm  تعیین شدند. نتایج میکروسکوپ الکترونی نشان داد که اندازه نانوذرات کیتوسان کمتر از nm100 است و بر اساس نتایج زتاسایزر اندازه ذرات قبل از تثبیت در محدوده nm300-10 و بعد از تثبیت آنزیم در محدوده nm500-20 بود. همچنین طیف FT-IR لیپاز آزاد و تثبیت شده بترتیب دارای پیک جذبی در طول موج cm-1 1645 و cm-1 9/1646 می­باشند که تثبیت لیپاز روی نانوذرات را تأیید نمود. pH بهینه لیپاز آزاد 7 و تثبیت شده، 5/7 بدست آمد. همچنین لیپاز آزاد در دمای °C30 وتثبیت شده در °C 40 بیشترین فعالیت را نشان داد. اگرچه میزان پایداری و نیمه عمر کمتری در مقایسه با آنزیم تثبیت شده داشت.

براساس نتایج مطالعه حاضر می­توان آنزیم لیپاز را بطور کووالان با واسطه گلوتارآلدئید با موفقیت روی نانوذرات کیتوسان تثبیت نمود و آنزیم تثبیت شده دارای فعالیت و خصوصیات سینتیکی مناسبی برای کاربرد در صنایع مختلف است.

کلمات کلیدی:نانوکیتوسان، لیپازسودوموناس، تثبیت، فعالیت آنزیم، خصوصیات سینتیکی

 

 

 

فهرست مطالب

عنوان    صفحه

چکیده: …………………………………………………………………………………… 1

 

فصل اول: مقدمات و کلیات

1-1-بیان مسئله …………………………………………………………………………. 3

1-2-اهداف تحقیق ………………………………………………………………………. 4

1-3-فرضیه های تحقیق…………………………………………………………………. 4

1-4- مفهوم نانوتکنولوژی ……………………………………………………………… 5

1-4-1-کاربردهای نانوتکنولوژی……………………………………………………….. 5

1-4-1-1- تولید مواد و محصولات صنعتی…………………………………………….. 5

1-4-1-2- پزشكي و بدن انسان………………………………………………………….. 6

1-4-1-3- پایداری منابع………………………………………………………………… 6

1-4-1-4- صنایع غذایی…………………………………………………………………. 6

1-5-آنزیم ها……………………………………………………………………………… 8

1-5-1-خصوصیات آنزيم ها…………………………………………………………….. 8

1-5-2- خصوصیات واکنشهای آنزیمی…………………………………………………. 11

1-5-3- پارامترهای موثر بر واکنشهای آنزیمی………………………………………… 14

1-5-3-1- دما……………………………………………………………………………. 14

1-5-3-2-pH ……………………………………………………………………………. 14

1-5-3-3-بازدارنده­ها……………………………………………………………………. 15

1-5-4- سینتیک واکنش آنزیمی…………………………………………………………. 16

1-5-5-عوامل موثر برسرعت و فعالیت آنزیمها ………………………………………. 17

1-5-5-1-اثر غلظت ماده اولیه برسرعت واکنش آنزیمی………………………………. 17

1-5-6- معادله میکائیلیس- منتن………………………………………………………… 18

1-5-7- معادله لینویور- برک …………………………………………………………… 21

1-5-8- آنزیم لیپاز……………………………………………………………………….. 23

1-5-8-1-كاربرد ليپاز…………………………………………………………………… 25

1-5-8-2- سینتیک واکنش لیپاز………………………………………………………… 27

1-5-8-3-روش های اندازه­گیری فعالیت لیپاز………………………………………….. 28

1-6- تثبيت آنزيم ……………………………………………………………………….. 30

1-6-1- انتخاب پایه و روش مناسب جهت تثبیت آنزیم…………………………………. 31

1-7- کیتین و کیتوسان ………………………………………………………………….. 32

1-7-1- کیتین……………………………………………………………………………. 33

1-7-2- کیتوسان…………………………………………………………………………. 34

1-7-2-1- کاربردهای کیتوسان…………………………………………………………. 35

1-8-تعیین مشخصات نانوذرات کیتوسان ………………………………………………. 38

فصل دوم: ادبیات و پیشینه تحقیق

 

2-1-مروری برمطالعات آنزیمی ……………………………………………………….. 41

2-2-مروری بر پیشینه آنزیم لیپاز ……………………………………………………… 42

2-3-تاریخچه تولید کیتین و کیتوسان …………………………………………………… 44

2-4-تاریخچه تثبیت آنزیم روی نانو ذرات ……………………………………………… 45

2-5-تحقیقات پیشین در این زمینه ………………………………………………………. 46

 

فصل سوم: مواد و روش ها

 

3-1- مقدمه ……………………………………………………………………………… 51

3-2-مواد شیمیایی ………………………………………………………………………. 52

3-3-وسائل و دستگاه های مورد نیاز …………………………………………………… 54

3-3-1-ظروف آزمایشگاهی…………………………………………………………….. 54

3-3-2-دستگاه­ها…………………………………………………………………………. 54

3-4-روش­های آزمایشگاهی بکار گرفته شده در پایان نامه …………………………….. 58

3-4-1-سنتز نانو ذرات کیتوسان ……………………………………………………….. 58

3-4-2-تثبیت آنزیم لیپاز  به روش اتصال کووالان بر اساس واکنش باز شیف………… 59

3-4-3-تعیین خصوصیات نانو ذره کیتوسان با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی 60

3-4-4-تعیین توزیع اندازه ذرات نانوکیتوسان سنتز شده به روش تفرق نور با استفاده از زتاسایزر          61

3-4-5-طیف سنجی مادون قرمز(FT-IR) …………………………………………….. 62

3-4-6- اندازه­گیری پروتئین تام به روش برادفورد……………………………………… 62

3-4-7-اندازه­گیری مقدار پروتئین (لیپاز) تثبیت شده بر روی نانوذره کیتوسان………… 63

3-4-8-اندازه­گیری فعالیت آنزیم لیپاز…………………………………………………… 63

3-4-8-1-منحنی استاندارد فعالیت لیپاز…………………………………………………. 64

3-4-8-2-روش اول- اندازه­گیری فعالیت لیپاز به روش کیت پارس آزمون (کیت تشخیصی کمی Lipase DC)  در سرم یا پلاسما به روش فتومتریک………………………………………………………. 66

3-4-8-3-روش دوم- اندازه­گیری فعالیت لیپاز با استفاده از سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (pNPP)   68

3-4-9- بررسی اثر دما بر فعالیت آنزیم لیپاز در حالت آزاد و تثبیت شده روی نانو کیتوسان       68

3-4-10-بررسی اثر pH بر فعالیت آنزیم لیپاز در حالت آزاد و تثبیت شده روی نانو کیتوسان     69

3-4-11-بررسی پارامتر های سینتیکی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان        69

فصل چهارم: نتایج

 

4-1-مقدمه ………………………………………………………………………………. 71

4-2-تصویر برداری میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) ……………………….. 71

4-3-طیف سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه (FT-IR) …………………………………. 72

4-4-توزیع اندازه نانوذرات سنتز شده با استفاده از زتا سایزر …………………………. 74

4-5-فعالیت لیپاز سودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانوذره کیتوسان ……………….. 75

4-6-بررسی اثر pH بر فعالیت آنزیم لیپاز سودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانوذره کیتوسان 76

4-7-مقایسه درصد فعالیت نسبی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده در pH های مختلف …… 77

4-8-بررسی اثر دما بر فعالیت آنزیم لیپاز سودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان 78

4-9-مقایسه درصد فعالیت نسبی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده در دماهای مختلف …….. 79

4-10-پارامترهای سینتیکی آنزیم لیپازسودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان       80

فصل پنجم: بحث و نتیجه­گیری

 

بحث………………………………………………………………………………………. 83

نتیجه گیری ……………………………………………………………………………… 87

مشکلات وپیشنهادات ……………………………………………………………………. 89

منابع و مآخذ……………………………………………………………………………… 90

فهرست منابع فارسی…………………………………………………………………….. 91

فهرست منابع غیر فارسی……………………………………………………………….. 92

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………… 100

فهرست جداول

عنوان    صفحه

جدول 1-1- نمونه­هایی ازکاربردهای صنعتی لیپاز …………………………………………… 26

جدول 1-2- مزایا و معایب تثبیت آنزیم ………………………………………………………. 31

جدول 1-3- کاربرد­های مختلف کیتوسان ……………………………………………………… 37

جدول 3-1- محتویات معرف شماره یک در pH=8  ……………………………………….. 66

جدول 3-2- محتویات معرف شماره دو در pH=4…………………………………………… 66

جدول 3-3- روش کار اندازه­گیری فعالیت لیپاز با استفاده از کیت پارس آزمون ……………. 67

جدول 4-1- اثر تغییرات pH بر فعالیت آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده روی نانو کیتوسان در دمای °C40 76

جدول 4-2- اثر تغییرات دما برفعالیت آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده بر روی نانو ذره کیتوسان در pH، 5/7     78

جدول 4-3- مقادیر پارامترهای سینتیکی ……………………………………………………… 80

فهرست نمودارها

عنوان    صفحه

نمودار 3-1- منحنی استاندارد جهت تعیین فعالیت لیپاز در طول موج 410 نانومتر به روش اسپکتروفتومتری 64

نمودار4-1- طیف مادون قرمز تبدیل فوریه آنزیم لیپاز سودوموناس آزاد ……………………. 73

نمودار4-2- طیف مادون قرمز تبدیل فوریه آنزیم لیپاز سودوموناس تثبیت شده روی نانوذره کیتوسان    73

نمودار4-3- زتا سایزر نانو ذرات کیتوسان قبل از تثبیت آنزیم لیپاز ………………………… 74

نمودار4-4-زتا سایزر ذرات کیتوسان لیپاز تثبیت شده با گلوتارآلدئید…………………………. 75

نمودار4-5- اثر   pHبر فعالیت آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده برروی نانو ذره کیتوسان ……. 76

نمودار4-6- مقایسه فعالیت نسبی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده در pH های مختلف ………… 77

نمودار4-7- اثر دما بر فعالیت آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده برروی نانو ذره کیتوسان ………. 78

نمودار4-8- مقایسه درصد فعالیت نسبی لیپاز آزاد و تثبیت شده سودوموناس در دماهای مختلف           79

نمودار4-10- منحنی میکائیلیس- منتن برای آنزیم لیپاز سودوموناس آزاد …………………… 81

نمودار4-11- منحنی میکائیلیس- منتن برای آنزیم لیپاز سودوموناس تثبیت شده بر روی نانو ذره کیتوسان       81

فهرست شکل ها

عنوان    صفحه

شکل 1-1- نمونه ای از مسیر واکنش برای واکنش کاتالیز شده ……………………………… 9

شکل 1-2- ساختار آنزیم ………………………………………………………………………. 10

شکل 1-3- الگوی القایی  مدل کوشلند- حالت دست دردستکش ………………………………. 15

شکل 1-4- اثر غلظت ماده اولیه بر سرعت واکنش آنزیمی………………………………….. 17

شکل 1-5- صورت اجمالی اثر غلظت ماده اولیه بر مقدار کمپلکس آنزیم- ماده اولیه تشکیل شده         18

شکل 1-6- منحنی فرضی واکنش آنزیمی ……………………………………………………. 19

شکل 1-7- منحنی اشباع آنزیمی ……………………………………………………………… 20

شکل 1-8- نمودار لینویور- برک …………………………………………………………….. 22

شکل 1-9- ساختار سه بعدی آنزیم لیپاز ………………………………………………………. 23

شکل 1-10- طرح شماتیکی واکنش لیپولیز ………………………………………………….. 28

شكل 1-11- رايج ترين روشهاي تثبيت ………………………………………………………. 32

شکل 1-12- مقایسه ساختار شیمیایی کیتین و سلولز …………………………………………. 33

شکل 1-13- ساختار کیتین و کیتوسان ……………………………………………………….. 35

شکل 1-14- مقایسه ساختارشیمیایی کیتین و کیتوسان و سلولز ……………………………… 38

شکل 3-1- فرمول شیمیایی گلوتارآلدئید……………………………………………………….. 52

شکل 3-2- فرم فضایی گلوتارآلدئید……………………………………………………………. 52

شکل 3-3- سانتریفیوژ مورد استفاده در این تحقیق……………………………………………. 54

شکل 3-4- سنیکیتور مورد استفاده در این تحقیق……………………………………………… 55

شکل 3-5- اسپکتروفتومتر مورد استفاده در این تحقیق……………………………………….. 55

شکل 3-6- استیرر مورد استفاده در این تحقیق………………………………………………… 56

شکل 3-7- شیکرلوله مورد استفاده در این تحقیق……………………………………………… 56

شکل 3-8-pH  متر مورد استفاده در این تحقیق………………………………………………. 57

شکل 3-9- ترازوی دیجیتال مورد استفاده در این تحقیق………………………………………. 57

شکل 3-10- حمام آبی مورد استفاده در این تحقیق……………………………………………. 58

شکل 3-11- میکروسکوپ الکترونی روبشی مورد استفاده در این تحقیق……………………. 60

شکل 3-12- دستگاه زتاسایزر مورد استفاده در این تحقیق……………………………………. 61

شکل 4-1- تصویر نانوذره کیتوسان با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) .. 72

قبلا حساب کاربری ایجاد کرده اید؟
گذرواژه خود را فراموش کرده اید؟
Loading...
enemad-logo