مقايسه مولكولي میگوی Penaeus semisulcatus و زيرگونه آن semisulcatus persicus با استفاده از بخشی از ژنوم میتوکندریایی

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                   صفحه

فصل اول: مقدمه و كليات

1-1 مقدمه……………………………………………………………………………………………………………………………………………………1

1-2- اهداف و فرضیه‌های تحقیق………………………………………………………………………………………………………………..2

1-2-1- فرضیه­ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………2

1-2-2- اهداف……………………………………………………………………………………………………………………………………………..2

1-3- جایگاه میگوهای پنائیده دربین سخت پوستان…………………………………………………………………………………2

1-4- معرفی میگوهای پنائیده…………………………………………………………………………………………………………………….3

1-5-  معرفی جنس Penaeus………………………………………………………………………………………………………………….5

1-6-  ژنتیک میگوهای خانواده پنائیده……………………………………………………………………………………………………….8

1-7- معرفی گونه‌های پنهان……………………………………………………………………………………………………………………….9

1-8- انواع نشانگرها…………………………………………………………………………………………………………………………………..10

1-8-1-  ژنوم میتوکندری………………………………………………………………………………………………………………………..12

1-9- پیشینه……………………………………………………………………………………………………………………………………………..15

1-9-1- مطالعات انجام شده در خارج………………………………………………………………………………………………………15

1-9-2- مطالعات انجام شده در ایران……………………………………………………………………………………………………….16

1-10- ضرورت اجرای پروژه……………………………………………………………………………………………………………………..18

فصل دوم:  مواد و روش­ها

2-1- مکان و مدت انجام پروژه…………………………………………………………………………………………………………………22

2-2- نمونه برداری…………………………………………………………………………………………………………………………………….22

2-3 مواد و وسایل مورد استفاده در این تحقیق……………………………………………………………………………………….22

2-3-1- مواد شیمیایی………………………………………………………………………………………………………………………………23

2-3-2- بافرها و محلول­ها…………………………………………………………………………………………………………………………23

2-3-3- نشانگرهای وزن مولکولی  DNA …………………………………………………………………………………………….24

2-3-4- آنزیم­ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………25

2-3-5- دستگاه‌های مورد استفاده……………………………………………………………………………………………………………25

2-3-6- آغازگرها……………………………………………………………………………………………………………………………………….26

2-3-7- سایر وسایل مورد نیاز………………………………………………………………………………………………………………….27

2-3-8 نرم افزارهای مورد استفاده …………………………………………………………………………………………………………..27

2-4- روش­ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………..28

2-4-1- روش‌های استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………………28

2-4-2- ارزیابی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده………………………………………………………………………….29

2-4-3- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز…………………………………………………………………………………………………………….31

2-4-4- بهینه سازی شرایط PCR………………………………………………………………………………………………………….32

2-4-5- الکتروفورز محصول PCR با استفاده از ژل آگارز 1 درصد و ثبت تصاویر………………………………..32

2-4-6- تعیین توالی محصولات PCR…………………………………………………………………………………………………….32

2-4-7- بازسازی توالی‌های هر نمونه……………………………………………………………………………………………………….33

2-4-8- آنالیز فیلوژنتیک توالی­ها با استفاد از نرم افزار……………………………………………………………………………33

فصل سوم : نتایج

3-1- نتايج بررسي كمي DNA استخراج شده……………………………………………………………………………………….36

3-1-1- ارزيابي كيفيت DNA استخراج شده با استفاده از روش الكتروفورز ژل آگارز…………………………36

3-1-2- ارزيابي كميت DNA استخراج شده با استفاده از روش اسپكتروفتومتري………………………………37

3-2- تکثیر و تعیین توالی­ ترادف نوکلئوتیدی بخشی از ژنوم میتوکندری……………………………………………..37

3-3- نتايج حاصل از تعیین توالی نواحی تکثیر شده ……………………………………………………………………………..40

3-3-1- مقایسه توالی های کامل حاصل از این تحقیق با سایر توالی های مشابه با استفاده از نرم افزار Blast…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………47

3-3-2- مقایسه ترادف نوکلئوتیدی حاصل از این تحقیق با هم دیگر و آنالیز فیلوژنتیک این توالی ها باهم و با سایر توالی های مشابه…………………………………………………………………………………………………………………48

3-3-3- مقایسه مولکولی گونه و زیرگونه بر اساس ژن ND2 و مطالعه آنالیز فیلوژنتیک آن ها با هم دیگر و با سایر گونه های مشابه………………………………………………………………………………………………………………….50

3-3-4- همردیفی ترادف نوکلئوتیدی و اسیدآمینه  ND2 در گونه و زیر گونه…………………………………….52

3-3-5- آزمون همردیفی و آنالیز فیلوژنتیک گونه و زیر گونه با هم دیگر و با سایر گونه های مشابه……54

3-4- مقایسه مولکولی گونه و زیرگونه بر اساس ژن  COIو مطالعه آنالیز فیلوژنتیک آن ها با هم دیگر و با سایر گونه های مشابه……………………………………………………………………………………………………………………………..60

3-4-1- همردیفی ترادف نوکلئوتیدی و اسیدآمینه ای COI در گونه و زیر گونه Clustal W………….61

3-4-2- آزمون همردیفی و آنالیز فیلوژنتیک گونه و زیر گونه با هم دیگر و با سایر گونه های مشابه……65

3-4-3- مقایسه مولکولی گونه و زیرگونه بر اساس ژن  COIIو مطالعه آنالیز فیلوژنتیک آن ها با هم دیگر و با سایر گونه های مشابه………………………………………………………………………………………………………………….70

3-4-4- همردیفی ترادف نوکلئوتیدی و اسیدآمینه ای COII در گونه و زیر گونه……………………………….71

3-4-5- آزمون همردیفی و آنالیز فیلوژنتیک گونه و زیرگونه با هم دیگر و با سایر گونه های مشابه…….73

3-5- مقایسه مولکولی گونه و زیرگونه براساس بخشی از ژنوم میتوکندری ( توالی کامل حاصل از این تحقیق) و مطالعه آنالیز فیلوژنتیک آن ها با هم دیگر و با سایر گونه های مشابه…………………………………….79

3-5-1- آزمون همردیفی بخشی از ژنوم میتوکندری (قطعه نهایی تعیین توالی شده حاصل از این تحقیق) از گونه و زیرگونه با هم دیگر……………………………………………………………………………………………………….79

3-5-2- مطالعه روابط فیلوژنتیک میان گونه ببری سبز و زیرگونه آن با هم دیگر و با سایر گونه های مشابه براساس قطعه ای از ژنوم میتوکندری با طول تقریبی 3830 جفت باز…………………………………………85

فصل چهارم: بحث و نتیجه گیری

بحث……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………91

نتیجه­گیری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………95

پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..96

منابع……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………98

فهرست جداول

عنوان                                                                                                   صفحه

جدول1-1-  معرفی جنس­های خانواده پنائیده…………………………………………………………………………………………..3

جدول 1-2- گونه­های جنس Penaeus برحسب زیرجنس و تاریخ نام­گذاری…………………………………………4

جدول1-3- خصوصیات مورفولوژیک Penaeus semisulcatus…………………………………………………………..8

جدول1-4- انواع نشانگرهای آلوزیمی و غیره و کاربرد آن‌ها……………………………………………………………………11

جدول 2-1- دستگاه‌های مورد استفاده در این تحقیق…………………………………………………………………………….26

جدول2-2- آغازگرهای مورد استفاده در این تحقیق……………………………………………………………………………….27

جدول2-3- میزان و ترکیبات استفاده شده در واكنش PCR…………………………………………………………………32

جدول 3-1- میزان جذب نوری و غلظت DNA در نمونه های PER وSEM…………………………………….37

جدول3-2- ترتیب ژن ها در ترادف نوکلئوتیدی بخشی از ژنوم میتوکندری زیر گونه……………………………46

جدول3-3- ترتیب ژن ها در ترادف نوکلئوتیدی بخشی از ژنوم میتوکندری گونه………………………………….46

جدول3-4- تعدادی از گونه­های جنس Penaeus با شماره­های ژنی که در آنالیز ND2  استفاده شده است…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….50

جدول3-5- ترکیب نوکلئوتیدی توالی­های ND2 در نمونه های حاصل از این تحقیق و سایر گونه های مشابه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..55

جدول 3-6- تخمین MCL  الگوی جانشین نوکلئوتیدهای ND2 نمونه های حاصل از این تحقیق و سایر گونه مشابه…………………………………………………………………………………………………………………………………………55

جدول 3-7- فاصله ژنتیکی محاسبه شده میان سایر گونه ها براساس بخشی از ترادف نوکلئوتیدی       ND2…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………56

جدول 3-8- فاصله ژنتیکی محاسبه شده میان گونه و زیر گونه و سایر گونه های مشابه براساس ترادف اسیدآمینه ای……………………………………………………………………………………………………………………………………………..59

جدول3-9- ترکیب نوکلئوتیدی توالی­های COI در نمونه های حاصل از این تحقیق و سایر                           گونه های مشابه………………………………………………………………………………………………………………………………………….66

جدول 3-10- تخمین MCL  الگوی جانشین نوکلئوتیدها در COI نمونه های حاصل از این تحقیق و سایر گونه های مشابه…………………………………………………………………………………………………………………………………66

جدول 3-11- فاصله ژنتیکی برای COI میان داده­های حاصل از این تحقیق و تعدادی از گونه­های جنس پنئوس……………………………………………………………………………………………………………………………………………..67

جدول 3- 12- فاصله ژنتیکی  محاسبه شده میان گونه و زیرگونه و سایر گونه های مشابه براساس ترادف اسیدآمینه ای  coi…………………………………………………………………………………………………………………………………….69

جدول 3-13- ترکیب نوکلئوتیدی توالی­های COII در نمونه­های حاصل از این تحقیق و سایر گونه­های مشابه.. ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….74

جدول 3-14- تخمین MCL  الگوی جانشین نوکلئوتیدها در COII نمونه های حاصل از این تحقیق با سایر گونه های مشابه……………………………………………………………………………………………………………………………..75

جدول 3-15- فاصله ژنتیکی محاسبه شده میان گونه ، زیرگونه و سایر گونه های مشابه براساس توالی نوکلئوتیدی COII…………………………………………………………………………………………………………………………………….75

جدول 3-16- فاصله ژنتیکی محاسبه شده میان گونه و زیر گونه و سایر گونه های مشابه براساس ترادف پروتئینی COII…………………………………………………………………………………………………………………………………………78

جدول 3-17- تعدادی از گونه های جنس پنئوس که جهت آنالیز فیلوژنتیک مورد استفاده قرار                  گرفته اند……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..86

جدول3-18- ترکیب نوکلئوتیدی توالی­های کامل گونه و زیر گونه و سایر گونه ها………………………………..87

جدول3-19 تخمین MCL  الگوی جانشین نوکلئوتیدها در نمونه حاصل از این تحقیق و سایر گونه های مشابه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..87

جدول 3-20- فاصله ژنتیکی محاسبه شده میان نمونه­ گونه و زیرگونه و سایر گونه ها  براساس طول کامل……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………88

 

 

 

فهرست اشكال

عنوان                                                                                                   صفحه

شکل1-1- تصویر شماتیک میگو واجزای تشکیل دهنده آن (FAO, 2004) ………………………………………..6

شکل1-2- الگوی رنگ‌بندی بدن و آنتن شلاقی در گونه……………………………………………………………………………7

شکل 1-3- نقشه ژنی ژنوم میتوکندری گونه­های جنس Penaeus………………………………………………………14

شکل 2-1- الگوی حرکتی مارکرمورد استفاده در این تحقیق…………………………………………………………………25

شکل 2-2- تصویری شماتیک از همپوشانی پرایمرهای مورد استفاده در این تحقیق…………………………….26

شکل 2-3- مراحلPCR  به صورت شماتیک………………………………………………………………………………………….31

شکل 3-1- الگوی حرکتی DNA ژنومی روي ژل آگارز1%……………………………………………………………………36

شکل3-2- الگوی حرکتی ناحیه توالی mtF1R1…………………………………………………………………………………..38

شکل 3-3- الگوی حرکتی  ناحیه   mtF2R2……………………………………………………………………………………….39

شکل3-4- الگوی حرکتی محصول PCR توالی  mtF3R3………………………………………………………………….39

شکل3-5- بخشی از ژنوم میتوکندری در Per و Sem  که با استفاده از پرایمرهای اختصاصی تکثیر و تعیین توالی شده اند…………………………………………………………………………………………………………………………………..43

شکل3-6- ترادف نوکلئوتیدی حاصل از این تحقیق از ژنوم میتوکندری میگوی ببری سبز(Sem) و زیر گونه آن (Per)……………………………………………………………………………………………………………………………………………45

شکل 3-7- نسخه Blast ترادف نوکلئوتیدی تعیین شده در این تحقیق برعلیه بانک ژنی…………………..48

شکل3-8- توالی نوکلئوتیدی ND2 در زیرگونه (الف)، گونه (ب) …………………………………………………………51

شکل3-9- توالی اسیدهای آمینه در زیر گونه (الف) ، و گونه (ب) …………………………………………………………52

شکل3-10- نتایج همردیفی ترادف نوکلئوتیدی (الف) و اسیدهای آمینه ای (ب) آنزیم ND2 گونه    (Sem) و زیرگونه (Per) ………………………………………………………………………………………………………………………..54

شکل3-11- درخت فیلوژنتیکی براساس ترادف نوکلئوتیدی ND2 و  روش های Neighbor-Joining  (الف) و Maximum likelihood (ب) ……………………………………………………………………………………………….58

شکل3-12- درخت فیلوژنتیکی براساس ترادف اسیدهای آمینه ND2 و روش های Neighbor-Joining (الف) و Maximum likelihood (ب) ……………………………………………………………………………..59

شکل 3-13-ترادف نوکلئوتیدی COI در زیرگونه (الف) وگونه (ب) ……………………………………………………..60

شکل 3-14- توالی پروتئینی coi  در زیر گونه (الف) و گونه (ب) …………………………………………………………61

شکل3-15- نتایج همردیفی ترادف نوکلئوتیدی (الف) و اسیدهای آمینه ای (ب) آنزیم COI گونه (Sem)   و زیرگونه (Per) ……………………………………………………………………………………………………………………..65

شکل3-16- درخت فیلوژنتیکی براساس ترادف نوکلئوتیدی COI و روش های  Neighbor-Joining (الف) و Maximum likelihood (ب) ……………………………………………………………………………………………….68

شکل3-17- درخت فیلوژنتیکی براساس ترادف اسیدآمینه ای coi و روش های Neighbor-Joining (الف) و Maximum likelihood (ب) ……………………………………………………………………………………………….70

شکل 3-18- توالی نوکلئوتیدی COII در زیرگونه (الف) و گونه(ب) ……………………………………………………70

شکل3-19- توالی اسیدآمینه ای coii در زیر گونه(الف) و گونه (ب) ……………………………………………………71

شکل3-20- نتایج همردیفی ترادف نوکلئوتیدی (الف) و اسیدهای آمینه ای (ب) آنزیم COII گونه (Sem) و زیرگونه (Per) ………………………………………………………………………………………………………………………..73

شکل3-21- درخت فیلوژنتیکی براساس ترادف نوکلئوتیدی COII و روش های Neighbor-Joining (الف) و Maximum likelihood (ب………………………………………………………………………………………………….77

شکل3-22- درخت فیلوژنتیکی براساس ترادف اسیدآمینه ای COII براساس روش های Neighbor-Joining (الف) و Maximum likelihood (ب…………………………………………………………………………………78

شکل 3-23- نتایج همردیفی نوکلئوتیدی نهایی از گونه و زیرگونه با هم دیگر………………………………………85

شکل3-24- درخت فیلوژنتیکی براساس قطعه ای حدودا 3880 جفت بازی از ژنوم میتوکندری گونه و زیرگونه و تعدادی از گونه های مشابه با روش های Neighbor-Joining (الف) و Maximum likelihood……………………………………………………………………………………………………………………………………………..89

فهرست نشانگرهای اختصاری:

 

 

D-loop: Displacement Loop

DMSO: Dimethyl Sulfoxide  

dsDNA: Double Strand DNA

GOP:Gap Onening Penalty

INN: Nearest Neighbor Interchang

ITS: Internal Transcribed Spacer

MAS: Multiple Sequence Alighnment

MCL: Maximum Composite Liklihood

MEGA: Molecular Evolution Genetic Analysis

NOR: Nucleolar Organizer Region

PCR: Polymerase Chain Reaction

SDS: Sodium Dedocil Sulfat

sp: species

ssDNA: Single Strand DNA

TAE: Tris-Base Glacial Acetic Acid EDTA

TE: Tris-Base EDTA

TES: Tris EDTA SDS