مطالعه ی تاثیر آسپیرین و گلایکیشن بر ساختار و عملکرد کاتالاز کبد گاو

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                            صفحه                      

مقدمه:

1- کاتالاز. 1

1-1- بررسی تاریخچه ی آنزیم کاتالاز. 1

1-2- نقش فیزیولوژکی کاتالاز در سیستم های زیستی و غیر زیستی. 3

1-3- نقص و فعالیت بیش از حد کاتالاز. 5

1-4- دسته بندی انواع کاتالازها 6

1-4-1- کاتالازهای حقیقی (کاتالاز های حاوی هِم تک- عملکردی) 7

1-4-2- کاتالاز- پراکسیدازها 8

1-4-3- کاتالازهای فاقد هِم یا منگنز کاتالازها 9

1-5- بررسی جزﺋـیات ساختاری کاتالازها 12

1-5-1- ساختار سه بعدی کاتالاز کبد گاو. 13

1-5-2- ساختار چهارم کاتالاز کبد گاو. 17

1-5-3- جایگاه فعال کاتالاز کبد گاو. 18

1-5-4- NADPH، کوفاکتور کاتالاز. 23

1-6- واکنش های مختلف کاتالاز. 26

1-6-1- مکانیسم عمل کاتالاز. 29

1-6-2- مهارکننده های کاتالاز. 30

1-7- دیابت.. 31

1-8- گلایکیشن. 32

1-8-1- حفاظت در برابر گلایکیشن. 34

1-8-2-آسپیرین. 35

1-9- اهداف پایان نامه. 37

مواد و روش ها:

2-1- مواد 39

2-2- روش ها 40

2-2-1- تهیه ی بافر. 40

2-2-2- تعیین غلظت محلول پراکسید هیدروژن. 41

2-2-3- تهیه ی محلول کاتالاز. 41

2-2-4- مطالعات سینتیکی آنزیم طبیعی. 42

2-2-5- مطالعات سینتیکی آنزیم در حضور آسپیرین. 42

2-2-6- مطالعات سینتیکی آنزیم در حضور قندها 42

2-2-7- مطالعات طیف سنجی فلوﺋورسانس.. 43

2-2-8- مطالعات دورنگ نمایی دورانی. 43

2-2-9- مطالعات طیف سنجی  مرﺋـی – ماوراء بنفش.. 44

نتایج و یافته ها:

3-1- مطالعات سینتیکی. 49

3-1-1- سنجش فعالیت آنزیم 49

3-1-2- بررسی تاثیر آسپیرین بر فعالیت آنزیم 53

3-1-3- بررسی تاثیر گلایکیشن بر فعالیت آنزیم کاتالاز کبد گاو. 54

3-2- مطالعات ساختاری.. 56

3-2-1- مطالعات فلوﺋورسانس آنزیم در حضور آسپیرین. 56

3-2-2- مطالعه ی تأثیر گلایکیشن بر طیف نشری کاتالاز. 66

3-3- مطالعات CD.. 77

3-3-1- مطالعه ی تاثیر گلایکیشن با دو قند گلوکز و فروکتوز بر ساختار دوم کاتالاز. 80

3-4- تغییرات در طیف آنزیم کاتالاز کبد گاو در اثر مجاورت با لیگاندهای مختلف.. 91

3-4-1- مطالعات طیف سنجی مرﺋـی – ماوراء بنفش در حضور آسپیرین. 91

3-4-2- مطالعات طیف سنجی مرﺋـی- ماوراء بنفش آنزیم کاتالاز کبد گاو در حضور قندها 93

3-4-3- بررسی تاثیر آسپیرین بر کاتالاز گلایکه و فروکته. 97

بحث و نتیجه گیری:

4-1- بحث.. 103

4-1-1- تأثیر آسپیرین بر فعالیت و ساختار آنزیم کاتالاز. 104

4-1-2- اهمیت پدیده ی گلایکیشن. 107

4-2-نتیجه گیری کلی. 113

4-3-پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………….114

مراجع. 115

 

فهرست جداول

عنوان                                                                                                       صفحه             

جدول 1-1- تعدادی از کاتالازها با ساختار کریستالی معین……………………………….. 12

جدول 3-1- پارامترهای ترمودینامیکی و اتصالی آسپرین به کاتالاز در دو دمای 25 و 37 درجه ی

سانتیگراد …………………………………………………………………………………….. 65

جدول 3-2- پارامترهای ترمودینامیکی و اتصالی برای کمپلکس کاتالاز گلایکه شده با قند گلوکز و

آسپیرین در دو دمای 25 و 37 درجه ی سانتیگراد………………………………………….. 76

جدول 3-3- پارامترهای ترمودینامیکی و اتصالی برای کمپلکس کاتالاز گلایکه شده با قند فروکتوز و

آسپیرین در دو دمای 25 و 37 درجه ی سانتیگراد………………………………………….. 76

جدول 3-4- تغییرات در ساختار دوم آنزیم کاتالاز در غیاب و حضور غلظت های مختلف آسپیرین در

دمای 25 درجه ی سانتیگراد…………………………………………………………………. 78

جدول 3-5- تغییرات در ساختار دوم آنزیم کاتالاز در غیاب وحضور غلظت های مختلف آسپیرین در

 دمای 37 درجه ی سانتیگراد………………………………………………………………… 78

جدول 3 – 6- تغییرات  در ساختار دوم کاتالاز در اثر انکوباسیون با گلوکز در زمان های مختلف در دمای

 25 درجه ی سانتیگراد………………………………………………………………………. 81

جدول 3- 7- تغییرات  در ساختار دوم کاتالاز در اثر انکوباسیون با گلوکز درزمان های مختلف در دمای

 37 درجه ی سانتیگراد………………………………………………………………………. 81

جدول 3-8- تغییرات  در ساختار دوم کاتالاز در اثر انکوباسیون با فروکتوز در زمانهای مختلف دردمای

 25 درجه ی سانتیگراد          ……………………………………………………………… 84

جدول 3 – 9- تغییرات  در ساختار دوم کاتالاز در اثر انکوباسیون با فروکتوز در زمانهای مختلف در دمای

 37 درجه ی سانتیگراد          ……………………………………………………………… 84

 جدول 3-10- تغییرات در ساختار دوم کاتالاز گلایکه در حضور غلظت های مختلف آسپیرین در دمای

 25 درجه ی سانتیگراد………………………………………………………………………. 87

جدول 3-11- تغییرات در ساختار دوم کاتالاز  گلایکه در حضور غلظت های مختلف آسپیرین در دمای

37 درجه ی سانتیگراد………………………………………………………………………….        87

جدول 3-12- تغییرات در ساختار دوم کاتالاز فروکته در حضور غلظت های مختلف آسپیرین در دمای

25 درجه ی سانتیگراد………………………………………………………………………….        89

جدول 3-13- تغییرات در ساختار دوم کاتالاز فروکته در حضور غلظت های  مختلف آسپیرین در دمای

 37 درجه ی سانتیگراد………………………………………………………………………. 89

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                               صفحه

شکل 1-1- مقایسه ساختمان و اندازه ی انواع مختلف کاتالاز……………………………… 11

شکل 1-2-  مقایسه ی یک زیرواحد مستقل از کاتالاز کبد گاو،  پنی سیلیوم ویتال و ترموس ترموفیلوس         16

شکل 1-3-  یک تترامر کاتالاز کبد گاو………………………………………………………. 17

شکل1- 4-  تصویری از جایگاه فعال کاتالاز اریتروسیت انسان ……………………………. 23

شکل 1-5- نحوه ی اتصال 4 مولکول NADPH  به تترامر کاتالاز در SCC-A ………… 27

شکل 1-6- واکنش ها و مبادلات چهار حالت مختلف کاتالاز در پستانداران………………….. 29

شکل1-7-  ساختار شیمیایی تعدادی از محصولات نهایی گلایکیشن (AGEs)……………… 33

شکل1-8- ساختار شیمیایی آسپیرین یا استیل سالیسیلیک اسید ………………………………. 35

شکل 1-9- مکانیسم هایی که توسط آنها آسپیرین متابولیسم گلوکز را بهبود می بخشد………. 36

شکل3-1-  مقایسه ی توالی دو پروتـﺌـین کاتالاز کبد گاو و کاتالاز اریتروسیت انسان……….. 47

شکل 3-2- مقایسه ی  ساختار سه بعدی کاتالاز کبد گاو وکاتالاز اریتروسیت انسان………… 48

شکل3-3-  نمودار تغییرات جذب پراکسید هیدروژن (20 میلی مولار) در بازه ی زمان……. 50

شکل3-4- نمودار میکاﺌـیلیس– منتن آنزیم کاتالاز کبد گاو در حضور غلظتهای مختلف سوبسترای  پراکسید

 هیدروژن……………………………………………………………………………………… 51

شکل 3-5- نمودار لاینویور- برک  (  بر حسب )  آنزیم کاتالاز………………………… 52

شکل 3-6- درصد تغییرات فعالیت آنزیم کاتالاز کبد گاو در حضور غلظت های مختلف آسپیرین      53

شکل 3-7- نمودار کاهش درصد فعالیت کاتالاز پس از گذشت 36 دقیقه انکوباسیون با گلوکز 55

شکل 3-8- نمودار کاهش درصد فعالیت کاتالاز پس از گذشت 44 دقیقه انکوباسیون با فروکتوز 56

شکل 3-9- نمودارشدت نشر فلوﺋورسانس کاتالاز کبد گاو درغیاب و حضور غلظت های مختلف آسپرین

در دمای 25 درجه ی سانتیگراد……………………………………………………………… 58

شکل 3-10- نمودار شدت نشر فلوﺋورسانس کاتالاز کبد گاو درغیاب و در حضورغلظتهای مختلف آسپیرین

 در دمای 37 درجه ی سانتیگراد…………………………………………………………….. 59

شکل 3-11- نمودار شدت نشر فلوﺋورسانس غلظتهای مختلف آسپیرین در دمای 25 درجه ی

 سانتیگراد…………………………………………………………………………………….. 60

شکل 3-12- نمودار تغییرات در نشر ماکزیمم فلـوﺋورسانس کاتالاز کبد گاو در حضور غلظتهای مختلف

 آسپیرین………………………………………………………………………………………. 61

شکل 3-13- نمودار استرن – ولمر کاتالاز در حضور غلظت های مختلف آسپیرین………… 62

شکل 3-14- نمودار در برابر log [Q] جهت تعیین مقادیر ثابت اتصال و تعداد آسپیرین های

متصل شده روی کاتالاز………………………………………………………………………. 64

شکل 3-15- نمودار شدت نشر فلوﺋورسانس کاتالاز کبد گاو در اثر انکوباسیون با گلوکز به مدت

 30 دقیقه……………………………………………………………………………………… 67

شکل 3-16- نمودار شدت نشر فلوﺋورسانس کاتالاز کبد گاو در اثر انکوباسیون با فروکتوز به مدت

 20 دقیقه……………………………………………………………………………………… 68

شکل 3-17- نمودار شدت  نشر فلوﺋورسانس کاتالاز گلایکه با گلوکز تحت تأثیر غلظت های افزایشی

آسپیرین……………………………………………………………………………………….. 70

شکل 3-18- نمودارشدت نشر فلوﺋورسانس کاتالاز گلایکه با فروکتوز تحت تأثیر غلظت های افزایشی

 آسپیرین………………………………………………………………………………………. 71

شکل 3-19- تغییرات در نشر ماکزیمم فلوﺋورسانس کاتالاز گلایکه (گلوکز و فروکتوز) در حضور غلظتهای

 افزایشی آسپیرین……………………………………………………………………………… 72

شکل 3-20- نمودار استرن – ولمر کاتالاز گلایکه  (گلوکز و فروکتوز) در حضور غلظت های افزایشی

آسپیرین……………………………………………………………………………………….. 73

شکل 3-21- نمودار در برابر log [Q] جهت تعیین مقادیر ثابت اتصال و تعداد آسپیرین های

متصل شده بر روی کاتالاز گلایکه (گلوکز و فروکتوز)……………………………………… 75

شکل 3- 22- طیف های CD  ناحیه  دور آنزیم کاتالاز در حضور غلظت های مختلف آسپیرین      79

شکل 3-23-  طیف های  CD ناحیه  دور آنزیم کاتالاز پس از انکوباسیون با گلوکز در زمان های

 مختلف……………………………………………………………………………………….. 82

شکل 3-24- طیف های CD  ناحیه  دور آنزیم کاتالاز  پس از انکوباسیون با فروکتوز در زمان های

 مختلف ………………………………………………………………………………………. 85

شکل 3-25- طیف های  CD ناحیه  دور آنزیم کاتالاز پس از انکوباسیون با گلوکز و قرارگیری

در معرض آسپیرین…………………………………………………………………………… 88

شکل 3-26- طیف های CD  ناحیه  دور آنزیم کاتالاز پس از انکوباسیون با فروکتوز و قرارگیری

 در معرض آسپیرین………………………………………………………………………….. 90

شکل 3-27- تغییر جذب آنزیم کاتالاز در طول موجهای 280  و 405 نانومتر تحت تاثیر غلظت های

افزایشی آسپیرین………………………………………………………………………………. 92

شکل 3- 28- تغییرات در طیف جذبی آنزیم کاتالاز در اثر مجاورت با غلظت های افزایشی آسپیرین 93

شکل 3-29- تغییر  جذب آنزیم کاتالاز در طول موجهای 280 و 405  نانومتر پس از 32 دقیقه

 انکوباسیون با گلوکز…………………………………………………………………………. 94

شکل 3-30- تغییرات در طیف جذبی آنزیم کاتالاز در اثر انکوباسیون با گلوکز در زمان های مختلف            95

شکل 3-31- تغییر جذب آنزیم کاتالاز در طول موجهای 280 و 405 نانومتر پس از 44 دقیقه

انکوباسیون با فروکتوز ………………………………………………………………………. 96

شکل 3-32- تغییرات در طیف جذبی آنزیم کاتالاز در اثر انکوباسیون با فروکتوز در زمان های مختلف         97

شکل 3-33- تغییر در جذب کاتالاز گلایکه در طول موجهای 280 و 405 نانومتر  تحت تأثیر

 غلظت های افزایشی آسپیرین………………………………………………………………… 98

شکل 3-34- تغییر در جذب کاتالاز فروکته در طول موجهای 280 و 405 نانومتر  تحت تأثیر

 غلظت های افزایشی آسپیرین………………………………………………………………… 99

شکل 3-35- تغییرات در طیف جذبی آنزیم کاتالاز لایکه شده با گلوکز به مدت 32 دقیقه  در اثر مجاورت

با غلظت های افزایشی آسپیرین……………………………………………………………… 100

3-36- تغییرات در طیف جذبی آنزیم کاتالاز  فروکته به مدت 44 دقیقه  در اثر مجاورت با غلظت های

افزایشی آسپیرین……………………………………………………………………………… 101

شکل 4-1-  مقایسه ی فرآیند گلایکیشن توسط دو قند گلوکز و فروکتوز……………………. 110