%31تخفیف

غربالگری اکتینومایست‌های نگهداری شده در کلکسیون میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران برای تولید ترکیبات ضد سرطان ریه

تعداد 117صفحه در فایل word

کارشناسی ارشد((M.Sc))

گرایش: میکروبیولوژی

 

 

غربالگری اکتینومایست‌های نگهداری شده در کلکسیون میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران برای تولید ترکیبات ضد سرطان ریه

چکیده

در این پژوهش توان تولید ترکیبات ضد سرطان ریه در اکتینومیست‌های بومی ایران که در مرکز کلکسیون میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران(UTMC) نگهداری می‌شوند مورد بررسی قرار گرفت.

ابتدا 40 سویه اکتینومیست که در دمای 70- درجه سانتیگراد نگهداری می‌شدند به صورت تصادفی انتخاب شدند و مراحل اسپورزایی، پیش تخمیر و تخمیر آنها انجام شد. میزان سمیت عصاره‌های استخراج شده به دو روش  تست آرتمیا (assay Brine Shrimp) و تست رنگ سنجی (MTT) برروی دودمان سلولی A549 سنجیده شد. پنج سویه UTMC 863،UMC 877 ،UTMC 919 ، UTMC 638، UTMC 676 اثرات کشندگی روی دودمان سلولی A549 داشتند که نتایج تست سلولیMTT، نتایج بررسی ریخت شناسی سلولی را نیز تایید کرد. پنج سویه منتخب تحت شناسایی مورفولوژیک و مولکولی قرار گرفتند. نتایج این بررسی نشان داد که سویه UTMC 676 دارای 86/99% شباهت به Streptomyces aureoverticillatus (شماره دسترسی AY999774) و سویه UTMC 638 دارای 78/98% شباهت به Streptomyces cacaoi subsp. cacaoi (شماره دسترسی AB184115) همچنین سویه های UTMC 863 وUTMC 877 به ترتیب دارای 85/99% و100% شباهت به Nocardia carnea (شماره دسترسی BAFV01000017) و نیز سویه UTMC 919 دارای 29/99% شباهت به سویه Kribbella sancticallisti (شماره دسترسی AM778577) می باشند. باتوجه به اینکه اکتینومیست‌ها توانایی تولید ترکیبات ضد سرطان را دارا می‌باشند،عصاره‌ی سویه‌های تولید کننده بدست آمده در این پروژه فعالیت ضد سرطانی خوبی را نشان دادند .  نیاز به کشف داروهای جدید به علت مقاومت دارویی سرطان‌ها هرچه بیشتر احساس می‌شود از این رو پیشنهاد می‌شود عصاره این متابولیت‌ها تخلیص و شناسایی شوند.

کلمات کلیدی: اکتینومیست، غربالگری، دودمان سلولی A549، تست آرتمیا، تست MTT، ترکیبات ضد سرطان

فهرست مطالب

عنوان                                              صفحه

چکیده…………………………………………………………………………………………………………………………………………1

فصل اول: کلیات                                                                                           

1-1-             سرطان……………………………………………………………………………………………………………………………….3

1-2-  علل سرطان………………………………………………………………………………………………………………………..3

1-3-  خصوصیات سلول توموری…………………………………………………………………………………………………..5

1-4-  روش ‌های درمان سرطان……………………………………………………………………………………………………..6

1-5-                                                                                                                                                                                           تاریخچه ی شیمی درمانی…………………………………………………………………………………………………. 6

1-6-  مقاومت دارویی…………………………………………………………………………………………………………………..7

1-7-  فارماکولوژی پایه داروهای شیمی درمانی سرطان…………………………………………………………………….8

1-7-1- داروهای آلکیله کننده………………………………………………………………………………………………………8

1-7-2- آنتی متابولیت‌ها……………………………………………………………………………………………………………..8

1-7-3- هورمون‌ها……………………………………………………………………………………………………………………..9

1-7-4- فراورده‌‌های گیاهی………………………………………………………………………………………………………….9

1-7-5- آنتی بیوتیک‌های ضدسرطان…………………………………………………………………………………………..10

1-7-5-1- اکتینومایسین…………………………………………………………………………………………………………..11

1-7-5-1-1- داکتینومایسین……………………………………………………………………………………………………..11

1-7-5-2-آنتراسیکلین………………………………………………………………………………………………………………13

1-7-5-2-1-دانوروبیسین………………………………………………………………………………………………………….14

1-7-5-2-2-دوکسوروبیسین هیدروکلراید…………………………………………………………………………………..16

1-7-5-3- میترامایسین………………………………………………………………………………………………………………17

1-7-5-4 بلئومایسین سولفات…………………………………………………………………………………………………….19

1-7-5-5- میتومایسین‌ها……………………………………………………………………………………………………………21

1-7-5-5-1 میترامایسین C………………………………………………………………………………………………………..22

1-7-5-6- استرپتوزوستین…………………………………………………………………………………………………………22

1-8-سرطان ریه………………………………………………………………………………………………………………………..23

1-8-1- علائم سرطان ریه……………………………………………………………………………………………………….. 26

1-8-2- سرطان در ایران…………………………………………………………………………………………………………… 26

1-9-اکتینومیست‌ها…………………………………………………………………………………………………………………….28

1-9-1-متابولیت‌های ثانویه‌ی اکتینومیست‌ها………………………………………………………………………………….30

1-10-هدف از پژوهش………………………………………………………………………………………………………………33

فصل دوم: پیشنه‌ی تحقیق                                                                                               

فصل سوم: مواد و روش­ها                                                                                              

3-1-  ترکیبات استفاده شده………………………………………………………………………………………………………….39

3-2-  دستگاه های استفاده شده……………………………………………………………………………………………………42

3-3-  سویه‌های اکتینومیست………………………………………………………………………………………………………..43

3-4-  آماده‌سازی محیط کشت تولید اسپور باکتری………………………………………………………………………….43

3-5-  آماده‌سازی محیط پیش کشت………………………………………………………………………………………………44

3-6-  آماده‌سازی محیط کشت تخمیر……………………………………………………………………………………………44

3-7-  احیا و کشت سویه…………………………………………………………………………………………………………….45

3-8-  تهیه پیش کشت……………………………………………………………………………………………………………… 45

3-9-  تولید متابولیت‌ها………………………………………………………………………………………………………………45

3-10- استخراج متابولیت‌ها………………………………………………………………………………………………………45

3-11- نگهداری عصاره‌ها………………………………………………………………………………………………………..46

3-12- غربالگری اولیه، ارزیابی فعالیت سمیت……………………………………………………………………………46

3-12-1- کشت آرتمیا……………………………………………………………………………………………………………..46

3-12-2- آزمون ارزیابی سمیت در آرتمیا…………………………………………………………………………………..47

3-13- غربالگری ثانویه، ارزیابی سمیت در کشت سلولی……………………………………………………………..48

3-13-1- انتخاب دودمان سلولی…………………………………………………………………………………………….. 48

3-13-1-1 محیط کشت………………………………………………………………………………………………………….49

3-13-1-1-1- مراحل تهیه محیط کشت دودمان سلولی A549…………………………………………………..49

3-13-1-1-2-تجدیدکشت دودمان سلولی A549……………………………………………………………………..50

3-13-1-1-3- شمارش سلول‌ها و بررسی میزان فعالیت سلول…………………………………………………..51

3-13-2- تهیه محلول تریپسین………………………………………………………………………………………………….52

3-14- آزمون MTT………………………………………………………………………………………………………………..53

3-15- شمارش سلول برای انجام آزمونMTT……………………………………………………………………………54

3-16- روش انجام آزمون MTT دراین پژوهش……………………………………………………………………….54

3-17- بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها تیمار شده با عصاره اکتینومیست‌ها……………………………………..55

3-18- شناسایی سویه‌های منتخب اکتینومیست………………………………………………………………………….56

3-18-1- بررسی مورفولوژی میکروسکوپی……………………………………………………………………………. 56

3-18-2- بررسی میسلیوم‌های هوایی و آرایش زنجیره اسپوری……………………………………………………56

3-18-3- بررسی رشد میسلیومی در محیطISP2 broth………………………………………………………………56

3-19-  مطالعه شیمیوتاکسونومی………………………………………………………………………………………………56

3-19-1- تهیه بیومس برای تعیین ایزومر دی آمینوپامیلیک اسید(DAP)……………………………………………56

3-19-2- تعیین ایزومر DAPموجود در دیواره سلولی…………………………………………………………………… 57

3-20- شناسایی توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA سویه‌های منتخب…………………………………………….. 58

3-20-1- تهیه محیط کشت Luria Broth(LB)……………………………………………………………………………..58

3-20-2- تهیه زیست توده برای مطالعات فیلوژنتیک……………………………………………………………………..59

3-20-3- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………………59

3-20-4- تائید بررسی کیفیت استخراج DNA………………………………………………………………………………61

3-20-4-1- تهیه ژل آگاروز……………………………………………………………………………………………………..61

3-20-4-1-1- تهیه بافر(TAE)Tris-Acetate-EDTA………………………………………………………………..61

3-20-5- انجام فرایند واکنش زنجیره پلیمراز(PCR)……………………………………………………………………..62

3-20-5-2- شرایط واکنش PCR………………………………………………………………………………………………62

3-20-5-3- بررسی محصولات PCR………………………………………………………………………………………..63

3-20-5-4- خالص سازی محصولات PCR……………………………………………………………………………….63

3-20-6- تعیین توالی نوکلئوتیدی قطعات تکثیر شده از ژن 16S rRNA………………………………………….63

3-20-7- مقایسه توالی نوکلئوتید ژن 16S rRNA سویه‌های اکتینومایست منتخب…………………………….63

فصل چهارم: نتایج                                                                                                       

4-1- شرایط پیش تخمیر و تخمیر و میزان متابولیت تولید شده توسط40 سویه  اکتینومیست‌ بررسی شده در این پژوهش………………………………………………………………………………………………………………………………65

4-2- نتایج حاصل از تست ارزیابی سمیت متابولیت‌های ثانویه………………………………………………………..68

4-3- نتایج مربوط به بررسی ریخت شناسی سلول‌ها در تست سمیت سلولی………………………………….. 71

4-4-  نتایج مربوط به تست سمیت سلولی با روش MTT……………………………………………………………….72

4-5-  بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها پس از تیمار با عصاره سویه‌ی اکتینومیست‌های منتخب………………74

4-6-  شناسایی اکتینومیست‌های منتخب………………………………………………………………………………………..74

4-6-1- بررسی ریخت شناسی اکتینومیست‌های منتخب…………………………………………………………………74

4-6-2- تعیین ایزومر DAP موجود در دیواره سلولی…………………………………………………………………… 76

4-6-3- بررسی فیلوژنتیکی اکتینومیست‌های منتخب………………………………………………………………………77

4-6-3-1- تائید استخراجDNA اکتینومیست‌های منتخب………………………………………………………………77

4-6-4- تائید استخراج ژن16S rRNA از ژل آگاروز……………………………………………………………………..77

4-6-4-1- نتایج مربوط به توالی خوانی ژن 16S rRNA……………………………………………………………….78

 فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری                                                                                      

 منابع……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 91

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………101

پیوست‌ها………………………………………………………………………………………………………………………….102

 

 

فهرست جداول

عنوان                                                                                                                  صفحه

جدول ‏1‑1: میزان شیوع و مرگ و میر ناشی از انواع سرطان در هر دو جنس زن ومرد.. 25

جدول ‏1‑2: تغییرات تنوع سرطان در ایران در طی سال‌های 1376-1318.. 27

جدول ‏1‑3:گروه‌های مختلف اکتینومیست‌ها.. 29

جدول ‏1‑4: تعدادی از متابولیت‌های استخراج شده توسط اکتینومیست‌ها   32

جدول ‏3‑1:مواد شیمایی استفاده شده.. 39

جدول ‏3‑2:دستگاه‌های استفاده شده.. 42

جدول ‏3‑3:ترکیبات محیط کشت ISP2 اصلاح شده.. 44

جدول ‏3‑4:ترکیبات محیط پیش تخمیر.. 45

جدول ‏3‑5:نمک‌های مورد نیاز برای تهیه آب نمک دریایی مصنوعی.. 46

جدول ‏3‑6:ترکیبات مورد استفاده درتهیه محیط کشت دودمان A549. 49

جدول ‏3‑7:ترکیبات محیط کشت.. 58

جدول ‏4‑1:نتایج حاصل از مرحله ی تولید واستخراج متابولیت‌های ثانویه   64

جدول ‏4‑2:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین 40-59% (محدوده اثر خوب).. 67

جدول ‏4‑3:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین 39-20% (محدوده اثر متوسط).. 69

جدول ‏4‑4:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین 0-19% (محدوده اثرضعیف).. 70

جدول ‏4‑5: نتایج مربوط به بررسی مرفولوژی سلول پس از تیمار با عصاره‌ها.. 70

جدول ‏4‑6: نتایج مربوط به مقایسه مقدار جذب بین عصاره‌ها با شاهد…………………………………………….. 72

جدول ‏4‑7: شماره دسترسی در Gene Bank ومیزان تشابه اکتینومیست‌های منتخب با اکتینومیست‌های ثبت شده براساس ترادف نوکلئوتید‌های ژن 16S rRNAدر ژنوم…………………………………………………………… 80

فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                                  صفحه

نمودار ‏4‑1:مقایسه میانگین مقدار جذب بین عصاره‌های سویه‌هایی که 05/0≥p داشتندبا شاهد(A549).. 73

                                                          

 

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                                  صفحه

شکل ‏1‑1: ساختمان شیمیایی داکتینومایسین.. 12

شکل ‏1‑2: ساختمان شیمیایی دانوروبیسین.. 14

شکل ‏1‑3: ساختمان شیمیایی دوکسوروبیسین.. 16

شکل ‏1‑4: ساختمان شیمیایی میترامایسین.. 17

شکل ‏1‑5:ساختمان شیمیایی بلئومایسین.. 18

شکل ‏1‑6:ساختمان شیمیایی میتومایسین.. 20

شکل ‏1‑7: ساختمان شیمیایی استرپتوزوستین.. 22

شکل ‏3‑1: این تصاویر به عنوان نمونه از میزان آسیب می‌باشد که برای درک بهتر هر مفهوم آسیب دیدگی……………………………………………………………………………………………………………………………………….54

شکل ‏4‑1: تصاویر مربوط به بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها پس از تیمار سلول A549 با عصاره باکتری‌ها…………………………………………………………………………………………………………………………………….73

شکل ‏4‑2: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 863. 74

شکل ‏4‑3: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 919. 74

شکل ‏4‑4: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 877. 74

شکل ‏4‑5: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 676. 75

شکل ‏4‑6: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 638. 75

شکل ‏4‑7: مربوط به استخراج DNA اکتینومیست‌های منتخب.. 76

شکل ‏4‑8: مربوط به استخراج ژن 16S rRNA می‌‌باشد.. 77

 

 

فهرست پیوست‌ها

پیوست‏4‑1.. 102

پیوست‏4‑2.. 102

پیوست‏4‑3.. 106

پیوست‏4‑4… 121

عنوان کامل

اختصار

National Cancer Institute

NIC

Food and Drug Administration

FDA

Non-Small Cell Lung Cancer

NSCLC

Small Cell Lung Cancer

SCLC

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a yellow tetrazole

MTT

Tris-acetate-EDTA

TAE

Polymerase Chain reaction

PCR

World Health Organization

WHO

University of Tehran Microorganism Collection

UTMC

Diaminopimelic acid

DAP

University of Tehran Biological collection

UTBC

DiMethyl SulfOxide

DMSO

 فهرست اختصارات

نقد و بررسی‌ها

هنوز بررسی‌ای ثبت نشده است.

اولین کسی باشید که دیدگاهی می نویسد “غربالگری اکتینومایست‌های نگهداری شده در کلکسیون میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران برای تولید ترکیبات ضد سرطان ریه”

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

قبلا حساب کاربری ایجاد کرده اید؟
گذرواژه خود را فراموش کرده اید؟
Loading...
enemad-logo