شناسایی باکتری باسیلوس سرئوس با روش مبتنی برPCR و استفاده از نانوذرات طلا

فهرست

عنوان                                                                                                       صفحه

فصل اول: مقدمه و کليات

1-1- مقدمه ……………………………………………………………………………………………………. …………………………………………………………2

2-1- پاتوژن­های موادغذایی………………………. .5

1-2-1- باسيلوس………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. …. 6

2-2-1- باسیلوس سرئوس .. 7

3-2-1- مکانيزم بيماري­زايي و جنبه­هاي کلينيکي .. 8

4-2-1- سایر بیماری­های ناشی از باسیلوس سرئوس.. 8

5-2-1- توکسين­های باسیلوس سرئوس.. 9

3-1- واکنش زنجیره­ای پلیمراز ………………………………………………………………………………………………………………………………. 10

4-1- PCR  چندگانه……………………………………………..   11

5-1- بیوسنسور DNA …………………………………………………………………………………………………………………………………………… 12

1-5-1- بیوسنسورهای نوری  DNA.. 13

2-5-1- شناسایی بر پایه پلاسمون رزونانس سطحی.. 13

6-1- روش سنتز نانوذرات ……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 15

1-6-1- احیاء شیمیایی توسط سدیم سیترات.. 15

7-1- کاربرد نانوذرات طلا…………………………………………………………………………………………………………………………………. 15

فصل دوم: مروری بر منابع

1-2- مروری بر مطالعات انجام شده در تشخیص باسیلوس سرئوس.. 19

2-2- مروری بر مطالعات انجام شده در استفاده ازPCR  چندگانه.. 24

3-2- مروری بر مطالعات انجام شده در استفاده از نانوذرات.. 25

فصل سوم: مواد و روش­ها

1-3- تجهیزات مورد نیاز………………………………………………………………………………………………………………………………………… .. 28

2-3- مواد مصرفی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….29         

3-3- استرين باکتری مورد مطالعه …………………………………………………………………………………………………………….. 30

4-3- بررسي خصوصيات بيوشيميايي و فيزيولوژيكي استرين باسیلوس سرئوس   30

1-4-3- آزمون هيدروليز نشاسته و کاتالاز به روش Dye. 30

2-4-3- آزمون متيل رد به روش Cowan. 31

3-4-3- آزمون سيترات با محيط کشت سيمون سيترات آگار.. 31

4-4-3- توانایی حرکتی باسیلوس سرئوس SIM .. 31

5-4-3- بررسی مورفولوژی باکتری.. 32

5-3- کشت باکتری………………………………………………………………………. 33

1-5-3- محیط کشت نوترینت مایع.. 32

2-5-2- محیط کشت نوترینت جامد.. 32

6-3- استخراجDNA………………………………. 33

7-3- ارزیابی کمی و کیفی DNA استخراج شده…………. 35

1-7-3- اسپکتروفتومتری.. 35

2-7-3- الکتروفورز.. 35

1-2-7-3- محلول­ها و بافرها………………………………………………………    36

2-2-7-3- روش انجام الكتروفورز ژل آگارز………………………………………………..   37

3-2-7-3- عكس برداري از ژل آگارز…………………………………………… 38

8-3- انتخاب ژن اختصاصی گونه باسيلوس سرئوس……………………………………………………………………………………… 39

9-3- انجام واكنش PCR……………………………………………………………… 41

10-3- بهينه سازي دماي انجام واکنش PCR پرایمرهای ژن nheB.. 42

      1-10-3- تعیین اختصاصیت پرایمرهای ژن nheB……………….   42

2-10-3- تعيين حساسیت پرایمرهای طراحی شده ژن nheB.. 42

11-3- بهينه سازي دماي انجام واکنش PCR پرایمرهای ژن nblD.. 43

12-3- واكنش PCR چندگانه……………………………………………………………. 43

1-12-3- بهينه سازي دماي انجام واکنش PCR پرایمرهای ژنnheB  و nblD   43

1-12-3- تعيين اختصاصیت پرایمرهای طراحی شده ژن nheB  و nblD.. 43

2-12-3- تعيين حساسیت پرایمرهای طراحی شده ژن nheB  و nblD.. 43

13-3- بررسی رشد باکتری در رقت سریالی………………………………. 44

1-13-3- تعیین حساسیت پرایمرهای طراحی شده در غلظت­های CFU باکتری   44

14-3- تعيين توالي محصول PCR بخشی از ژن تکثیر یافته nheB.. 44

1-14-3- آناليز توالي حاصل از تعيين توالي بخشی از توالی ژن nheB   44

1-1-14-3- بررسی تشابه توالی ژن  nheBباسیلوس سرئوس با سایر توالی­ها   45

2-1-14-3- بررسی پروتئین nheB……………………………………………………………………………………………….... 45

15-3- طراحی شناساگرهای متصل به نانوذرات طلا از نقاط مشترک گونه باسیلوس سرئوس.. 46

16-3- سنتز نانوذرات طلا…………………………………………………………………………………………………………………….   47

17-3- تولید اولیگونوکلئوتیدهای تغییریافته با تیول……………………………………………………………………………………………… 48

1-17-3- آماده سازی اولیگونوکلئوتیدهای تغییر یافته برای اتصال   48

18-3- استفاده از پروب نانوذرات طلا برای شناسایی باکتری باسیلوس سرئوس   49

1-18-3- بررسی اختصاصیت شناساگرهای طراحی شده.. 49

2-18-3- بررسی حساسیت شناساگرهای طراحی شده.. 491

÷

1-4- بررسی خصوصیات بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی باسیلوس سرئوس   51

1-1-4- آزمون هيدروليز نشاسته …………………………………………………………………………………………………… 51

2-1-4- آزمون متیل رد برای باسیلوس سرئوس…………………………………………………………………………………… 51

3-1-4- آزمون سیمون سیترات …………………………………………………………………………………………………………………………   52

4-1-4- بررسی توانایی حرکتی باسیلوس سرئوس SIM………………………………………………    52

2-4- بررسی مورفولوژی باکتری…………………………………………………………………………………………………………. 53

3-4- کشت باکتری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..54

4-4- نتایج استخراج DNA ژنومی…………………………………………………………………………………………………………………   55

1-4-4- نتایج بررسی اسپکتروفتومتری………………………………………………………………………………… 55

2-4-4- نتایج بررسی ژل آگارز …………………………………………………………………………………………………………….. 56

5-4- بررسی توالی ژن nheB جهت انتخاب توالی­های مناسب برای طراحی پرایمر و پروب .. 57

6-4- نتایج  بهينه­سازي دماي انجام واکنش PCR پرایمرهای ژن nheB   59

1-6-4-نتایج تعيين اختصاصیت پرایمرهای ژن  nheB ……………   60

1-6-4-نتایج تعيين حساسیت پرایمرهای طراحی شده ژن nheB.. 61

7-4- نتایج بهينه سازي دماي انجام واکنش PCR پرایمرهای ژن hblD   62

8-4- واکنش PCR چندگانه ……………………………………………………………………………………………………………….   63

1-8-4- بهينه سازي دماي انجام واکنش PCR پرایمرهای ژن hblD و nheB    64

2-8-4- نتایج تعيين اختصاصیت پرایمرهای ژن nheB و hblD.. 64

3-8-4- نتایج تعيين حساسیت پرایمرهای ژن nheB و hblD .. 65

9-4- نتایج تعیین حساسیت پرایمرهای طراحی شده ژن nheB در غلظت ­CFU   66

10-4- نتایج تعيين توالي محصول PCR ژن تکثیر یافته برای بخشی از ژن nheB   67

1-10-4- آناليز توالي حاصل از تعيين توالي ژنnheB  ……………………………………………………………………………………… 68

2-10-4- نتایج BLAST توالی nheB تکثیر شده در باکتری باسیلوس سرئوس    69

3-10-4- بررسی تشابه توالی ژن  nheBباسیلوس سرئوس با سایر توالی­ها    71

4-10-4- بررسی پروتئین nheB ……………………………………………………………………………………………………………………   73

1-4-10-4- چارچوب قالب خواندن باز پروتئین nheB…….. 73

2-4-10-4- بررسی برهم کنش پروتئین­های مرتبط با پروتئین nheB.. 74

5-10-4- بررسی خاصیت آلرژی­زایی پروتئین nheB …………………………………………………………………………………………….. 75

11-4- بررسی رشد باکتری در رقت سریالی…………………………………… 77

12-4- تصاوير نانوذرات طلا سنتز شده………………………………………. 77

13-4- بررسی نانوذرات طلا سنتز شده با استفاده از میکروسکوپالکترونی …………………………………………………………….78

14-4- طيف جذبي در سنتز نانوذرات طلا…………………………………. 79

15-4- نتایج استفاده از پروب نانوذرات طلا برای شناسایی باکتری باسیلوس سرئوس.. 80

1-15-4- اتصال اولیگو نوکلئوتیدهای تغییر یافته به DNA ژنومی   81

2-15-4- بررسی اختصاصیت شناساگرهای طراحی شده……… 81

3-15-4- تعیین حساسیت شناساگرهای طراحی شده……………….   83

16-4 بحث و نتیجه­گیری …………………………………………………………………..  ……………………………………. 84

17-4 نتیجه­گیری کلی ………………………………………………………………………………………………………….. 91

18-4 پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………….. ……….  92

منابع …………………………………………………………………………………………………………… 9

فهرست شکل­ها

عنوان                                                                                                       صفحه

1-1: موقعیت سه ژن nheB ,nheA  و nheC …………………………………………………………………………………………………..10

2-1: تأثیر فاصله نانوذرات طلا برروی رنگ آن­ها…………………………………………………………………………………………………….14

3-1: روش سنتز نانوذرات طلا …………………………………………………………………………………………………………………………………15

4-1: تصویر شماتیک برای تشخیص با استفاده از نانوذرات طلا………………………………………………………………………………17

1-3: جایگاه پروب­های تیوله برای اتصال به نانوذرات طلا………………………………………………………………………………………47

2-3: آماده سازی اولیگونوکلئوتیدهای تغییر یافته با تیول……………………………………………………………………………………..48

1-4: آزمون هيدروليز نشاسته………………………………………………………………………………………………………………………………….51

2-4: تست متیل رد…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..52

3-4: تست سیمون سیترات………………………………………………………………………………………………………………………………………52

4-4: تست SIM………………………………………………………………………………………………………………………………………………………53

5-4: کشت باکتری به منظور رنگ­آمیزی…………………………………………………………………………………………………………………53

6-4: بررسی مورفولوژی باسیلوس……………………………………………………………………………………………………………………………..54

7-4: کشت باکتری در محیط کشت جامد……………………………………………………………………………………………………………….55

8-4: DNA استخراج شده با دو روش استفاده از کیت و جوشاندن………………………………………………………………………57

9-4: شکل هم­ردیفی بخشی از ژن nheB……………………………………………………………………………………………………………….58

10-4: نتیجه الکتروفورز مربوط به PCR شیب دمایی با آغازگر ژن nheB  ……………………………………………………….60

11-4: فرآیند PCR تعيين اختصاصیت پرایمرهای ژن nheB……………………………………………………………………………..61

12-4: تعيين حساسیت پرایمرهای بکاررفته……………………………………………………………………………………………………………62

13-4: نتیجه الکتروفورز مربوط به PCR شیب دمایی hblD………………………………………………………………………………..63

14-4: الکتروفورز مربوط به PCR شیب دمایی با ژن­های  nheB وhblD…………………………………………………………..64

15-4: تعیین اختصاصیت پرایمر­های دو ژن nheB وhblD…………………………………………………………………………………..65

16-4:حساسیت پرایمرهای بکاررفته…………………………………………………………………………………………………………………………66

17-4: حساسیت پرایمر برای ژن  nheB در غلظت های CFU  باکتری…………………………………………………………….67

18-4: توالی ژن nheB …………………………………………………………………………………………………………………………………………. 67

19-4: تعيين توالي فرستاده شده……………………………………………………………………………………………………………………………..69

20-4: ثبت توالی ژنnheB  باکتری باسیلوس سرئوس 11778……………………………………………………………………………71

21-4: درخت فیلوژنی ژن nheB باسیلوس سرئوس……………………………………………………………………………………………….73

22-4: رسم چارچوب قالب باز خواندن……………………………………………………………………………………………………………………..74

23-4: بررسی ارتباط مولکولی…………………………………………………………………………………………………………………………………..74

24-4 : ساختار مولکولی پروتئین……………………………………………………………………………………………………………………………..75

25-4: بررسی پروتئین nheB در SDAP……………………………………………………………………………………………………………..76

26-4: بررسی پروتئین در Appel…………………………………………………………………………………………………………………………..76

27-4: بررسی رشد باکتری در رقت­های سریالی …………………………………………………………………………………………………….77

28-4: تغییر رنگ درسنتز نانوذرات طلا……………………………………………………………………………………………………………………78

29-4: تصوير نانوذرات طلا سنتزشده……………………………………………………………………………………………………………………….79

30-4: طيف جذبي مربوط به نانوذرات طلا………………………………………………………………………………………………………………79

31-4: طيف جذبي مربوط به نانوذرات طلا………………………………………………………………………………………………………………80

32 -4: تغییرات طیف ناشی از اتصال پروب با نانوذرات طلا……………………………………………………………………………………81

33-4: تعيين اختصاصیت شناساگرهای متصل به نانوذرات طلا………………………………………………………………………………82

34-4 : مقایسه حساسیت PCR با نانوذرات طلا…………………………………………………………………………………………………….83

فهرست جداول

عنوان                                                                                                       صفحه

1-3: تجهیزات مورد نیاز در آزمایشگاه    ……………………………………………………………………………………..28

2-3: مواد مورد استفاده در آزمایشگاه ………………………………………………………………………………………….29

3-3: استرین­های بکار رفته در این تحقیق …………………………………………………………………………………..30

4-3: مواد و مقادیر مورد نیاز برای بافر الکتروفورز 10X ………………………………………………………………..36

5-3: توالی پرایمرهای طراحی شده ………………………………………………………………………………………………40

6-3: مواد واکنش PCR ………………………………………………………………………………………………………………….41

7-3: برنامه به کار گرفته شده در واکنش PCR …………………………………………………………………………….41

8-3: توالی پروب­های تیوله برای اتصال به نانوذرات طلا………………………………………………………………………………………….46

1-4: نتایج حاصل از بررسی کیفیت پرایمرهای کاندید در IDT…………………………………………………….59

2-4: نتیجه بلاست توالی ژنی فرستاده شده در پایگاه داده NCBI………………………………………………..70