جداسازی و شناسایی باکتری ترشح کننده لیپاز خارج سلولی و مقاوم به حلال آلی و کاربرد آن در تولید بیودیزل

 

فهرست مطالب

عنوان                                                      صفحه

فصل اول

مقدمه………………………………….. 2

1-1- آنزیم های مقاوم به حلال های آلی……….. 2

1-2- لیپازها……………………………. 4

1-3-منابع آنزیم لیپاز……………………. 5

1-3-1- لیپازهای گیاهی……………………. 5

1-3-2-لیپازهای جانوری……………………. 5

1-3-3- لیپازهای میکروبی………………….. 5

1-4- طبقه بندی لیپازها…………………… 7

1-5- ساختار لیپازها……………………… 8

1-5-1- ساختار لیپازها و مقاومت آن ها به حلال های آلی 8

1-6- مکانیسم عمل لیپازها…………………. 8

1-7- انواع واکنش های لیپازی………………. 9

1-8- واکنش در حلال های آلی……………….. 11

1-9- باکتری های مقاوم به حلال های آلی:…….. 11

1-10- کاربردهای صنعتی لیپازها و لیپازهای مقاوم به حلال آلی    12

1-11- سوخت های زیستی …………………… 12

عنوان                                                      صفحه

1-10-1-اتانول زیستی…………………….. 13

1-10-2- گاز زیستی………………………. 14

1-10-3- سوخت سبز……………………….. 14

1-10-4- زیست دیزل یا بیودیزل…………….. 14

1-10-4-1- روش های تولید بیودیزل:…………. 15

1-10-4-2- کاتالیزورهای واکنش ترانس استریفیکاسیون… 18

1-10-4-2-1- کاتالیزورهای قلیایی………….. 18

1-10-4-2-2- کاتالیزورهای اسیدی…………… 18

1-10-4-2-3- آنزیم ها (لیپازها) به عنوان کاتالیزورهای واکنش ترانس استریفیکاسیون………………………….. 19

1-10-4-2-4 – مزایا و محدودیت های استفاده از آنزیم ها (لیپازها) به عنوان

                      کاتالیزور به جای اسید و قلیا  20

فصل دوم

مروری بر پژوهش های پیشین………………… 22

اهداف پژوهش……………………………. 25

فرضیه…………………………………. 25

فصل سوم

ابزار ، مواد و روش ها…………………… 27

 

عنوان                                                       صفحه

3-1- ابزار و دستگاه ها………………….. 27

3-2- مواد شیمیایی و آزمایشگاهی…………… 28

3-3- نرم افزارها……………………….. 28

3-4- روش ها……………………………. 29

3-4-1- نمونه برداری…………………….. 29

3-4-1-1- تهیه ی نمونه ها………………… 29

3-4-1-2- آماده سازی نمونه ها…………….. 29

3-4-2- محیط های کشت باکتری………………. 30

3-4-2-1- محیط کشت جامد جهت جداسازی تک کلونی ها 30

3-4-2-2- شناسایی و جداسازی کلونی های باکتریایی 30

3-4-3- محیط کشت افتراقی جهت جداسازی باکتری های مقاوم به حلال آلی……………………………………… 30

3-4-4- جداسازی باکتری های ترشح کننده لیپاز خارج سلولی    31

3-4-4-1-محیط جامد تریبوتیرین آگار………… 31

3-4-4-2- محیط جامد Tween………………… 32

3-4-4-3- محیط جامد ردامین B- آگار………… 32

3-4-5- محیط ترشح آنزیم لیپاز خارج سلولی…… 33

3-4-6- تعیین خصوصیات مورفولوژیکی سویه IE-93… 35

3-4-6-1- رنگ آمیزی گرم………………….. 35

3-4-7-2- واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR)……. 36

عنوان                                                     صفحه

3-4-7-3- الکتروفورز محصول حاصل از PCR…….. 36

3-4-7-4- خالص سازی محصول PCR از ژل آگارز….. 37

3-4-7-5 – استفاده از نرم افزارهای بیوانفورماتیک برای تجزیه  و تحلیل توالی به دست آمده…………………. 38

3-4-8- سنجش فعالیت آنزیم لیپاز…………… 39

3-4-8-1- سنجش فعالیت آنزیمی به روش رنگ سنجی.. 39

3-4-8-1-1- استفاده از سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (PNPP)  39

3-4-8-1-2- استفاده ازسوبسترای پارانیتروفنیل بوتیرات (PNPB)    39

3-4-8-2- سنجش فعالیت آنزیمی به روش Cuppric reagent 40

3-4-10- تخلیص آنزیم لیپاز……………….. 41

3-4-10-1- جمع آوری آنزیم خام…………….. 41

3-4-10-2- آماده سازی فرایند دیالیز……….. 42

3-4-10-3- ستون Q-Sepharose………………… 42

3-4-10-3-1- بازیافت و بهبود رزین…………. 42

3-4-10-3-2- روش استفاده از ستون Q-Sepharose برای تخلیص 43

3-4-10-4-ستون Sephacryl S-200………………. 43

3-4-10-4-1-بازیافت و بهبود رزین………….. 43

3-4-10-4-2- روش استفاده از ستون Sephacryl S-200. 44

3-4-11- سنجش کمی پروتئین به روش برادفورد….. 44

 

عنوان                                                      صفحه

3-4-11- بررسی خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم لیپاز سویه IE-93   45

3-4-11-1- بررسی نیمرخ دمایی……………… 45

3-4-11-2- بررسی نیمرخ pH………………… 45

3-4-11-3- بررسی پایداری آنزیم در دماهای مختلف 46

3-4-11-4- بررسی پایداری آنزیم در pH های مختلف 46

3-4-11-5- بررسی اثر یون های فلزی بر فعالیت آنزیمی   47

3-4-11-6- بررسی اثر حلال های آلی:…………. 47

فصل چهارم

نتایج…………………………………. 50

4-1- نمونه برداری………………………. 50

4-2- جداسازی باکتری ها بر اساس مشخصات کلونی ها برروی محیط جامد……………………………………… 51

4-3- جداسازی باکتری های مقاوم به حلال آلی….. 52

4-4- غربال گری باکتری های ترشح کننده لیپاز خارج سلولی    53

4-5-شناسایی باکتری……………………… 56

4-5-1- خصوصیات مورفولوژیکی سویه IE-93……… 56

4-5-2- خصوصیات فیلوژنتیکی سویه IE-93………. 57

4-5-2-1- استخراج DNA…………………… 57

4-5-2-2- واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) ، تکثیر 16S rRNA و تعیین توالی…………………………………. 57

 

عنوان                                                      صفحه

4-5-2-3- تجزیه و تحلیل توالی به دست آمده وموقعیت فیلوژنی  باکتری

              stenotrophomonas sp.strain IE93در بین سایر باکتری ها. 58

4-6- محیط ترشح آنزیم لیپاز………………. 59

4-7- تخلیص آنزیم لیپاز………………….. 60

4-8- تعیین خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم………. 62

4-8-1- بررسی پارامترهای سنتیکی آنزیم……… 62

4-8-2- بررسی نیم رخ دمای آنزیم…………… 63

4-8-3- بررسی نیم رخ pH آنزیم…………….. 63

4-8-4- بررسی پایداری آنزیم در دماهای مختلف… 64

4-8-5- بررسی پایدای آنزیم در pH های مختلف…. 65

4-8-6- بررسی اثر یون های فلزی بر فعالیت آنزیمی 66

4-8-7- بررسی اثر حلال آلی………………… 67

فصل پنجم

بحث ونتیجه گیری………………………… 72

منابع…………………………………. 76

چکیده به انگلیسی

صفحه عنوان به انگلیسی

 

فهرست جدول‌ها

 عنوان                                                     صفحه

 

جدول 2-1-پژوهش های مختلف در زمینه تولید بیودیزل 24

جدول 3-1- اجزا محیط جامد تریبوتیرین………. 31

جدول 3-2 – اجزا محیط جامد Tween………….. 32

جدول 3-3-  اجزا محیط جامد B- ردامین……….. 33

جدول 3-4- اجزا محیط اولیه تولید لیپاز…….. 34

جدول 3-5- اجزا محیط های طراحی شده توسط نرم افزار Expert 8.0.7.1Design- ……………………………. 34

جدول 3-6 – نحوه تهیه مخلوط PCR…………… 36

جدول 3-7- شرایط بهینه سنجش فعالیت آنزیم طراحی شده توسط نرم افزار

                Design- Experte8.0.7.1………… 41

جدول 3-8 – اجزا مخلوط بافری……………… 46

جدول 4-1 – مشخصات نمونه ها………………. 50

جدول 4-2- باکتری های شناسایی شده…………. 52

جدول 4-3 – باکتریهای ترشح کننده لیپاز و مقاوم به حلال آلی 55

جدول 4-4 –اجزا محیط کشت اولیه……………. 59

جدول 4-5- ترشح آنزیم لیپاز در محیط های مختلف طراحی شده توسط برنامه

                 Design Expert……………… 59

 

عنوان                                                       صفحه

جدول 4-6-  اجزا محیط کشت بهینه……………. 60

جدول-4-7- مراحل خالص سازی آنزیم…………… 62

جدول-4-8- مراحل تثبیت آنزیم……………… 69

جدول 5-1- شرایط تولید بیودیزل……………. 75

فهرست شکل ها

عنوان                                                    صفحه

شکل 1-1- انواع واکنش های لیپازی………….. 10

شکل 1-2-  واکنش ترانس استریفیکاسیون………. 16

شکل 1-3- تبدیل تری گلیسرید به دی گلیسرید….. 16

شکل 1-4-تبدیل دی گلیسرید به مونوگلیسرید…… 17

شکل 1-5-تبدیل مونوگلیسرید به گلیسرول و اسید چرب 17

شکل 1-6- واکنش متانولایزیس……………….. 18

شکل 4-1-تک کلونی……………………….. 52

شکل 4-2- پلیت Tween…………………….. 54

شکل 4-3- پلیت ردامین B- آگار…………….. 54

شکل 4-4 – رنگ آمیزی گرم…………………. 56

شکل 4-5- رشد باکتری بر روی پلیت EMB……… 56

شکل 4-6 – ژل الکتروفورز محصول PCR………… 57

فهرست نمودارها

عنوان                                                      صفحه

نمودار 4-1 -کروماتوگرام مراحل خالص سازی لیپاز مربوط به سویه IE-93

                  از ستون کروماتوگرافی تعویض یونی   61

نمودار 4-2 -کروماتوگرام ستون ژل فیلتراسیون S-200 Sephacryl 61

نمودار 4-3 – منحنی میکائلیس – منتن و منحنی لینوور- برک   62

نمودار 4-4 – نیم رخ دمایی آنزیم…………… 63

نمودار 4-5 – نیمرخ pH آنزیم……………… 64

نمودار 4-6-پایداری آنزیم در دماهای مختلف در زمان 1 ساعت  65

نمودار 4-8 – اثر یون های مختلف بر فعالیت آنزیم 67

نمودار 4-9- اثر حلال های آلی بر فعالیت نسبی آنزیم 68

نمودار 4-10 – اثر غلظت های مختلف حلال آلی اتانول 68

نمودار 4-11 – اثر غلظت های مختلف حلال آلی متانول 69