جداسازی هم زمان ژن‏های عامل مقاومت افزایش یافته به آمینوگلیکوزیدهاaac(6ʹ)-Ie-aph(2ʹʹ)-Ia ، ant(4)-Іa،aph(3ʹ)-IIIa در انتروکوک های ایزوله شده از بیماران شهر تهران با روش مولکولی Triplex-PCR

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                        صفحه

چکیده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 1

فصل اول – مقدمه

1-1- بیان مسأله………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 2

1-2- ضرورت انجام تحقیق…………………………………………………………………………………………………………………………………. 3

1-3-اهداف تحقیق……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 3

1-4-فرضیه‏ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 4

1-5-تعریف واژه‏ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 4

فصل دوم – مروری بر تحقیقات انجام شده

2-1-تاریخچه باکتری انتروکوک………………………………………………………………………………………………………………………….. 5

2-2-تاکسونومی………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 7

2-3-فاکتورهای بیماری زایی……………………………………………………………………………………………………………………………….. 8

2-3-1-مواد تجمعی…………………………………………………………………………………………………………………………………………… 9

2-3-2-سیتولیزین………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 9

2-3-3-ژلاتیناز………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 10

2-3-4-فرمون………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 10

2-3-5-لیپوتیکوئیک اسید………………………………………………………………………………………………………………………………… 10

2-3-6-همولیزین انتروکوکوس فکالیس…………………………………………………………………………………………………………… 11

2-3-7-آنتی ژن آندوکاردیتی انتروکوکوس فکالیس………………………………………………………………………………………….. 11

2-3-8-پروتئین سطحی انتروکوکی (ESP )……………………………………………………………………………………………………… 11

2-3-9-ادهسین کلاژن انتروکوکوس فکالیس (ACE )……………………………………………………………………………………… 12

2-4-بیماری زایی……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 12

2-4-1-باکتریمی……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 12

2-4-2-عفونت های مجاری ادراری…………………………………………………………………………………………………………………. 13

2-4-3-اندوکاردیت…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 13

2-4-4-عفونت های داخل شکمی، لگنی وبافت های نرم………………………………………………………………………………….. 13

2-4-5-سایر عفونت های انتروکوکی……………………………………………………………………………………………………………….. 14

2-5-شناسایی انترکوک‏ها………………………………………………………………………………………………………………………………….. 14

2-6-درمان انترکوک‏ها………………………………………………………………………………………………………………………………………. 15

2-6-1-مقاومت آنتی بیوتیکی…………………………………………………………………………………………………………………………… 16

2-6-1-1-مقاومت به گلیکوپپتیدها………………………………………………………………………………………………………………….. 17

2-6-1-1-الف- عوامل زمینه ساز کلنیزاسیون انتروکوک های مقاوم به ونکومایسین(VRE)……………………………… 17

2-6-1-2-مقاومت به آنتی بیوتیک های بتالاکتام……………………………………………………………………………………………… 19

2-6-1-3-مقاومت به آنتی بیوتیک های تتراسایکلین……………………………………………………………………………………….. 20

2-6-1-4-مقاومت به لینکوزامیدها………………………………………………………………………………………………………………….. 20

2-6-1-5-مقاومت به استرپتوگرامین B وA……………………………………………………………………………………………………… 21

2-6-1-6-مقاومت به اگزازولیدون………………………………………………………………………………………………………………….. 21

2-6-1-7-مقاومت به اورنی مایسین………………………………………………………………………………………………………………… 22

2-6-1-8-مقاومت در برابر آنتی بیوتیک های ماکرولیدی………………………………………………………………………………… 22

2-6-1-9-مقاومت به کلرامفنیکل…………………………………………………………………………………………………………………….. 23

2-6-1-10-مقاومت به آمینوگلیکوزیدها…………………………………………………………………………………………………………. 24

2-6-1-10-الف- تاریخچه روند گسترش مقاومت های آمینوگلیکوزیدی……………………………………………………….. 25

2-6-1-10-ب- انواع مقاومت به آمینوگلیکوزیدها…………………………………………………………………………………………. 25

2-6-1-10-پ- اهمیت مقاومت آمینوگلیکوزیدی………………………………………………………………………………………….. 27

2-6-1-10-ت-HLAR و و افزایش مرگ ومیر……………………………………………………………………………………………….. 28

2-6-2-مقاومت چنددارویی( MDR)……………………………………………………………………………………………………………….. 28

2-7- روش های شناسایی سویه های مقاوم به آنتی بیوتیک……………………………………………………………………………….. 29

2-7-1- روش های مبتنی بر فنوتیپ………………………………………………………………………………………………………………… 29

2-7-1-1- روش انتشار دیسک در آگار( دیسک دیفیوژن)……………………………………………………………………………….. 29

2-7-1-2- روش تهیه رقت در محیط مایع( براث دیلوشن )…………………………………………………………………………….. 30

2-7-1-3 – روش تهیه رقت در محیط آگار( آگار دیلوشن )…………………………………………………………………………….. 30

2-7-2- روش های مبتنی بر ژنوتیپ………………………………………………………………………………………………………………… 31

2-7-2-1-Triplex-PCR……………………………………………………………………………………………………………………………….. 31

2-7-2-1-الف-طراحی واجرایTriplex-PCR………………………………………………………………………………………………. 32

2-7-2-1-ب-تیتراسیون اجزای واکنش………………………………………………………………………………………………………….. 33

2-7-2-1-3 -شرایط ترموسایکلر……………………………………………………………………………………………………………………. 33

2-8-اپیدمیولوژی عفونت های انتروکوکی………………………………………………………………………………………………………… 33

2-9-مروري بر پیشینه پژوهش………………………………………………………………………………………………………………………….. 35

فصل سوم – مواد و روش‏ها

3-1-وسایل موردنیاز…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 40

3-2-مواد موردنیاز……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 41

3-3-طریقه ساخت محیط های کشت………………………………………………………………………………………………………………… 43

3-3-1-محیط بلادآگار…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 43

3-3-2-محیط BHI براث…………………………………………………………………………………………………………………………………. 43

3-3-3-محیط مولر هینتون آگار……………………………………………………………………………………………………………………….. 44

3-3-4-محیط پایه قند……………………………………………………………………………………………………………………………………… 44

3-4-جمع آوری نمونه……………………………………………………………………………………………………………………………………… 45

3-5-جدا سازی سویه ها…………………………………………………………………………………………………………………………………… 45

3-6-نگهداری سویه ها……………………………………………………………………………………………………………………………………… 46

3-7-آنتی بیوگرام……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 46

3-7-1-تهیه سوسپانسیون باکتریایی………………………………………………………………………………………………………………….. 46

3-7-2-روش آنتی بیوگرام……………………………………………………………………………………………………………………………….. 47

3-8-بررسی مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین و استرپتومایسین……………………………………………………………………. 48

3-9-اجرای PCR……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 48

3-9-1-آماده سازی واستخراج ژنوم………………………………………………………………………………………………………………….. 48

3-9-1-1-جوشاندن………………………………………………………………………………………………………………………………………… 49

3-10-اندازه گیری غلظت DNA ژنومیک تخلیص شده……………………………………………………………………………………. 49

3-11-الکتروفورز محصول استخراج ژنوم………………………………………………………………………………………………………… 50

3-12-انتخاب و سنتز پرایمر…………………………………………………………………………………………………………………………….. 50

3-13-روش آماده سازی پرایمرها……………………………………………………………………………………………………………………… 51

3-13-1-محلول کاری پرایمر PCR…………………………………………………………………………………………………………………. 51

3-13-2- ترکیب واکنش PCR برای هر نمونه…………………………………………………………………………………………………. 52

3-14-انجام واکنش PCR…………………………………………………………………………………………………………………………………. 52

3-15-طریقه ساخت بافر…………………………………………………………………………………………………………………………………… 54

3-15-1-تهیه بافر(SX )TBE…………………………………………………………………………………………………………………………… 54

3-15-2-تهیه ژل Buffer  Loading  Gel……………………………………………………………………………………………………. 54

3-16-تهیه ژل الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………………… 55

3-16-1-تهیه‌ی ژل آگاروز جهت انجام الکتروفورز  ژنوم اسنخراج شده و محصول PCR………………………………… 55

3-17-تعیین توالی……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 55

فصل چهارم – نتایج و بحث

4-1-نتایج مربوط به جداسازی گونه های انتروکوکی از نمونه های بالینی………………………………………………………….. 56

4-2-نتایج حاصل از کشت انتروکوک ها بر روی محیط و رنگ آمیزی گرم……………………………………………………….. 57

4-3-نتایج حاصل از حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن………………………………………………………………. 61

4-4-نتایج حاصل از استخراج…………………………………………………………………………………………………………………………… 61

4-5-نتایج PCR……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 62

4-6-بحث………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 66

فصل پنجم – نتیجه‏گیری

5-1- نتیجه‏گیری………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 71

5-2-پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 72

منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 73

منابع غیرفارسی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 73

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 84

 

فهرست جدول‏ها

عنوان                                                                                                                        صفحه

جدول(3-1) اجزای تشکیل دهنده محیط بلاد آگار…………………………………………………………………………………………….. 43

جدول(3-2) اجزای تشکیل دهنده ی محیط BHI براث……………………………………………………………………………………… 43

جدول(3-3) اجزای تشکیل دهنده محیط مولر هینتون آگار………………………………………………………………………………… 44

جدول(3-4) اجزای تشکیل دهنده محیط پایه قند………………………………………………………………………………………………. 44

جدول(3-5) مشخصات دیسک های آنتی بیوتیکی استفاده شده………………………………………………………………………….. 48

جدول(3-6) پرایمرهای استفاده شده برای پیدا کردن به سویه های انتروکوکی مقاوم به آمینوگلیکوزیدی…………….. 50

جدول( 3-7)محلول کاری جهت پرایمر  aac(6ʹ)-Ie-aph(2ʹʹ)-Ia………………………………………………………………….. 51

جدول( 3-8 )محلول کاری جهت پرایمر  aph(3ʹ)-IIIa……………………………………………………………………………………. 51

جدول (3-9 )محلول کاری جهت پرایمر  ant(4)-Іa………………………………………………………………………………………… 51

جدول( 3-10) محلول کاری جهت PCR…………………………………………………………………………………………………………… 52

جدول(3-11) برنامه PCR  بهينه سازي شده براي جفت پرايمر aac(6ʹ)-Ie-aph(2ʹʹ)-Ia……………………………….. 53

جدول(3-12)برنامه PCR  بهينه سازي شده براي جفت پرايمر aph(3ʹ)-IIIa……………………………………………………. 53

جدول(3-13) برنامه PCR  بهينه سازي شده براي جفت پرايمر ant(4)-Іa……………………………………………………….. 54

جدول( 3-14) اجزای تشکیل دهنده بافر TBE………………………………………………………………………………………………….. 54

جدول(3-15) اجزای تشکیل دهنده ژل لودینگ بافر………………………………………………………………………………………….. 53

جدول( 4-1) درصد فروانی انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم در نمونه های بالینی…………………………… 60

جدول(4-2) درصدفراوانی سویه های انتروکوک  حاوی یک ژن در نمونه های بالینی………………………………………… 64

جدول(4-3) درصدفراوانی سویه های انتروکوک حاوی بیش از یک ژن در نمونه های بالینی……………………………… 66

فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                                        صفحه

نمودار(4-1) درصد فراوانی انتروکوک های جداسازی شده از نمونه های بالینی………………………………………………….. 57

نمودار(4-2) نتایج حاصل از روش دیسک دیفیوژن برای تمام ایزوله های انتروکوکی…………………………………………. 61

فهرست شکل‏ها

عنوان                                                                                                                        صفحه

شکل( 4-1) کشت در محیط5/6 درصد BHI Broth Nacl……………………………………………………………………………… 57

شکل(4-2) کشت روی محیط بلاد آگار ……………………………………………………………………………………………………………. 58

شکل(4-3 )رنگ آمیزی گرم انتروکوک و مشاهده توسط میکروسکوپ با بزرگنمایی 100X………………………………. 58

شکل(4-4) محیط کشت لاکتوز…………………………………………………………………………………………………………………………. 59

شکل(4-5) محیط کشت آرابینوز جهت افتراق دو گونه انتروکوک……………………………………………………………………… 59

شکل(4-6)  محیط کشت آرابینوز عدم رشد باکتری انتروکوکوس فکالیس………………………………………………………….. 60

شکل(4-7) الکتروفورز  نمونه‌هاي DNA  استخراج شده با روش جوشاندن بر روي ژل آگارز 1………………………… 61

شکل(4-8) نتایج اندازه گیری غلظت DNA استخراجی با روش جوشاندن با دستگاه نانودراپ……………………………. 62

شکل(4-9) نتایج حاصل از الکتروفورز ژن aac(6ʹ)-Ie-aph(2ʹʹ)-Ia و aph(3ʹ)-IIIa…………………………………….. 63

شکل(4-10) نتایج حاصل از الکتروفورز از ژن ant(4)-l a………………………………………………………………………………. 64

شکل(4-11) نتایج حاصل از الکتروفورز از ژن های مورد بررسی به روش Triplex-PCR…………………………………. 65