جداسازی لپتوسپیرا از خون و ادرار بیماران به وسیله­ PCR – RFLP

 

عنوان                                            فهرست مطالب                                           صفحه

خلاصه فارسی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 1

مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 2

فصل اول:کلیات

1-1-بیان مساله……………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 14

1-2-اهداف تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 15

1-3-فرضیه ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 15

1-4-تعاریف …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 16

1-4-1-واکنش زنجیره ای پلیمرازی (PCR) …………………………………………………………………………………………………. 16

1-4-2-مواد مورد نیاز و مراحل مختلف آزمایش PCR …………………………………………………………………………………. 20

1-4-2-1-آماده سازی نمونه……………………………………………………………………………………………………………………………….. 20

1-4-2-2-استخراج DNA………………………………………………………………………………………………………………………………… 20

1-4-3-سیکل های PCR ………………………………………………………………………………………………………………………………… 22

1-4-4-بررسی محصولات PCR……………………………………………………………………………………………………………………….. 22

1-4-5-RFLP  ………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 23

1-4-5-1-تاریخچه RFLP……………………………………………………………………………………………………………………………….. 23

1-4-5-3-کشف وعملکرد آنزیم های اندونوکلئاز محدودالاثر…………………………………………………………………………… 24

1-4-5-4-انجام واکنش برش با انزیم های اندونوکلئاز محدودالاثر در آزمایشگاه…………………………………………… 25

1-4-5-5-بررسی نتیجه برش با اندونوکلئاز محدودالاثر …………………………………………………………………………………. 27

فصل دوم:مروری بر متون گذشته

سوابق نظری 29 ………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 29

فصل سوم:مواد وروش ها

1-3- مواد  و وسایل لازم برای نمونه برداری…………………………………………………………………………………………………….. 34

2-3-مواد لازم برای آزمایشهای مولکولی (استخراج DNA،PCR والکتروفورز)…………………………………………… 34
3-3-وسایل لازم جهت آزمایشهای مولکولی………………………………………………………………………………………………………. 35

3-4-نمونه برداری وجداسازی 36………………………………………………………………………………………………………………………. 36

3-5-جداسازی پلاسما…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 36

3-6-جداسازی ادرار……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 36

3-7-استخراجDNA  ………………………………………………………………………………………………………………………………………… 37

3-8-آنالیز کیفی DNA…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 38

3-9-واکنشPCR……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 39

3-10-الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 41

3-11-طرز تهیه ژل آگارز الکتروفورز…………………………………………………………………………………………………………………. 41

3-12-بارگذاری محصول PCR…………………………………………………………………………………………………………………………. 41

3-13-روش کار RFLP……………………………………………………………………………………………………………………………………… 43

فصل چهارم:نتایج

4-1-نتیجه آنالیز کیفی استخراجDNA  ………………………………………………………………………………………………………… 45

4-2-نتیجه واکنش PCR  ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 45

4-3-نتیجه واکنش هضم آنزیمیRFLP …………………………………………………………………………………………………………. 51

فصل پنجم :بحث وپیشنهادات

 بحث……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 55

 پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 59

منابع وماخذ …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 61

خلاصه انگلیسی  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 69

ضمایم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 71

 

 

 

 

   عنوان                                       فهرست جداول                                            صفحه                           

جدول  شماره 1-1- بیماری های اصلی لپتوسپیرایی……………………………………………………………………………………….. 5

جدول شماره4-1-نتایج حاصل از PCR  در بیماران مشکوک به لپتوسپیروز در مازندران………………………….. 46

جدول شماره4-2- نتایج حاصل از PCR پلاسما در بیماران مشکوک به لپتوسپیروز در مازندران  ………….. 47

جدول شماره 4-3-نتایج حاصل از PCR ادرار در بیماران مشکوک به لپتوسپیروز در استان مازندران……… 47

جدول شماره 4-4-فراوانی بیماران مبتلا به لپتوسپیروز به تفکیک جنسیتی در مازندران…………………………… 47

جدول شماره 4-5-توزیع فراوانی بیماران مبتلا به لپتوسپیروز به تفکیک گروههای سنی در مازندران……….. 48

جدول شماره 4-6-توزیع فراوانی بیماران مشکو ک به لپتوسپیروز به تفکیک گروه های سنی وجنسی در مازندران      48

جدول شماره 4-7- توزیع فراوانی بیماران مشکو ک به لپتوسپیروز بر حسب اشتغال در مازندران……………… 49

جدول شماره 4-8- توزیع فراوانی بیماران مشکو ک به لپتوسپیروز بر اساس زمان خون گیری در مازندران 49

جدول شماره 4-9- توزیع فراوانی بیماران مشکو ک به لپتوسپیروز بر اساس میزان تماس با آب در مازندران   49

جدول شماره 4-10- توزیع فراوانی بیماران مشکو ک به لپتوسپیروز بر اساس میزان تماس با ادرار وفضولات حیوانات  50

جدول شماره 4-11- تعداد ودرصد علائم کلینیکی مشاهده شده در افراد مشکوک به لپتوسپیروز در مازندران 51

 

 

عنوان                                          فهرست نمودارها                                     صفحه

1-1-بیماریزایی لپتوسپیرا …………………………………………………………………………………………………………………………………………. 9

 

 

 

 عنوان                                            فهرست تصاویر                                     صفحه

تصویر شماره 3-1-استخراج DNA  ………………………………………………………………………………………………………………… 38

ستصویر شماره 3-2-دستگاه ترموسایکلر……………………………………………………………………………………………………………. 39

تصویر شماره 3- 3-مرحله اماده سازی محصول PCR  ………………………………………………………………………………….. 40

تصویر شماره 3-4-قرار دادن محصول PCR در دستگاه ترموسایکلر……………………………………………………………… 40

تصویر شماره 3-5- تانک الکتروفورز…………………………………………………………………………………………………………………… 42

تصویر شماره 4-1-نمایش بررسی کیفی DNA استخراج شده از باکتری…………………………………………………….. 45

تصویر شماره 4-2-ژل الکتروفورز محصول PCR  …………………………………………………………………………………………… 46

تصویر شماره  4-3-هضم آنزیمی قطعه ی bp274 و ایجاد دو قطعه 203 و71 نوکلئوتیدی……………………… 52