%53تخفیف

جداسازی بیوسورفکتانت از میکروارگانیسم¬های همزیست اسفنج و بررسی کارایی آن در ازدیاد برداشت میکروبی نفت (MEOR)

تعداد 155صفحه در فایل word

چکیده

اسفنج دریایی Halicona simulans از سواحل جزيره خاركو در خلیج فارس، با استفاده از غواصی در عمق 10-15 متری به دست آمد. بافت مزوهیل درونی اسفنج هموژنیزه شده و در محیط کشتهای مختلف مانند، مارین آگار شور، مارین آگار، SDA و EA کشت داده شد. باکتریهای Staphylococcus hominis DM122، Aneurinibacillus miqulanus B0270، Pseudomonas putida KT2440، Providencia rettqeri DSM 4542، Bacillus pumilus SAFR 032، Jeotqalicoccus halotolerans YKJ 101، Bacillus subtilis، Psychrobacter pacificensis P2K6 که همزیست با اسفنج فوق بودند، با استفاده از روشهای غربالگری از قبیل روش فعالیت همولیتیک، روش لیپاز و روش آب گریزی سطح سلول برای تولید بیوسورفکتانت غربالگری شدند. پس از اثبات تولید بیوسورفکتانت، ویژگیهای بیوسورفکتانت با استفاده از روشهای CTAB آگار، روش انحلال آنتراسن، روش انهدام قطرهی روغن، روش جابجایی روغن و شاخص امولسیون تعیین گرديد. در مرحلهی بعد شناسایی بیوشیمیایی و مولکولی انجام شد. برای شناسایی مولکولی از توالی یابی s rDNA16 استفاده شد. پس از تعیین توالی محصول نهایی، انجام blast و Clastal Wو استفاده از نرم افزارهای Chromas و mega 5.5 درخت فیلوژنی و فاصلهی ژنتیکی آنها تعیین شد. پس از شناسایی مولکولی دورهی زمانی رشد و تولید بیوسورفکتانت تعیین شد. نهایتا پایداری بیوسورفکتانت تولید شده با استفاده از روشهای پایداری در رنج وسیعی از دما، pH و شوری تعیین گردید. با NaCl2٪، Aneurinibacillus miqulanus B0270 با شاخص امولسیون بیش از 70٪، بیشترین میزان E24 را به خود اختصاص میدهد. سویهی Jeotqalicoccus halotolerans YKJ با شاخص امولسیون 90٪، بیشترین E24 را در pH 10 دارا میباشد. سویهی Pseudomonas putida KT2440، با شاخص امولسیون 100٪ بیشترین E24 را در دمای 100 درجهی سانتیگراد را دارا میباشد. نهايتا” مشخص گرديد که این بیوسورفکتانتها از نظر ساختمانی، در دماها، غلظتهای NaCl و pH های فوق العاده، فعال وپایدار باقی مانده و بنابراين به نظر مي رسد كه سويه هاي شناسايي شده در اين تحقيق و بيوسورفكتانت حاصل از آنها، پتانسيل بالايي جهت مطالعات بيشتر براي استفاده در صنايع مختلف به ویژه در (MEOR) را دارا باشند.

کلمات کلیدی: اسفنج، باكتري همزيست، خليج فارس، شناسايي مولكولي و بيوشيميايي، بيوسورفكتانت

دسته: زیست شناسی, علوم تجربی برچسب: باكتري همزيست, بيوسورفكتانت, خليج فارس, شناسايي مولكولي و بيوشيميايي, کلمات کلیدی: اسفنج

توضیحات

فهرست مطالب

( فصل اول: مقدمه. 1

1-1 مقدمه. 2

1-2 ویژگیهای عمومی اسفنجها 3

1-2-1 اجزاء اسکلتی و نگهدارندهی اسفنجها 5

1-2-2 طرز تشکیل سیخکها یا اسپیکولها و اجزاء اسکلتی دیگر. 6

1-2-3 جریان آب و شکل بدن اسفنجها 6

1-2-4 تغذیه اسفنجها 7

1-2-5 سيستم برون ريز. 9

1-2-6 سيستم عصبى يا حسى.. 9

1-2-7 تولید مثل اسفنجها 9

1-3 تقسیم بندی اسفنجها 10

1-3-1 ردهبندی شاخهی اسفنجها در سطح رده. 11

1-4 اسفنجهای خلیج فارس… 11

1-5 مواد استخراج شده از اسفنجها 12

1-5-1 مواد با خاصیت ضد تومور. 13

1-5-2 مواد ضد التهابی.. 14

1-5-3 مواد ضد باکتری.. 16

1-5-4 مواد ضد ویروسی.. 16

1-5-5 مواد ضد قارچ.. 17

1-6 میکرو ارگانیسمهای همزیست با اسفنج.. 17

1-6-1 میکروارگانیسمها در مکانهای مشخصی از اسفنج زندگی میکنند. 18

1-6-2 چرا میکروارگانیسمها در اسفنج زندگی میکنند؟. 19

1-6-3 نحوهی زندگی میکروارگانیسمها در اسفنجها 19

1-7 بیوسورفکتانتها 20

1-7-1 طبقه بندی بیوسورفکتانتها 21

1-7-2 نقش فیزیولوژیکی بیوسورفکتانت در میکروارگانیسمها 25

1-7-3 کاربردهای بیوسورفکتانت… 26

1-8 ضرورت انجام طرح.. 29

1-9 اهداف تحقیق.. 29

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده. 30

2-1 مروری بر تحقیقات انجام شده. 31

2-1-1 پژوهشهای مرتبط انجام شده در ایران.. 31

2-1-2 پژوهشهای انجام شده در سایر کشورها 32

فصل سوم: مواد و روشها 35

3-1 مواد و وسایل مورد استفاده. 36

3-1-1 مواد مربوط به جداسازی و شناسایی میکروارگانیسمها 36

3-1-2 دستگاههای مورد استفاده. 38

3-2 استریل سازی.. 38

3-3 نمونه برداری.. 39

3-4 آماده سازی نمونه. 40

3-5 محیط کشتهای مورد استفاده. 40

3-5-1 – محیط کشت مارین آگار. 40

3-5-2 محیط کشت مارین آگار شور. 41

3-5-3 محیط کشت Sabouruad dextrose agar (SDA) 42

3-5-4 محیط کشت امرسون آگار(EA) 42

3-6 روش تهیه محیط کشت… 43

3-7 خالص سازی کلنیهای رشد یافته در محیط کشتها 43

3-8 روشهای غربالگری برای جداسازی میکروارگانیسمهای تولید کننده بیوسورفکتانت… 43

3-8-1 روش فعالیت همولیتیک… 44

3-8-2 روش تولید لیپاز. 44

3-8-3 روش آب گریزی سطح سلول.. 45

3-9 تهیه محیط کشت مایع (محیط کشت تولید) 46

3-10 جداسازی بیوسورفکتانت… 47

3-11 ترسیم نمودار رشد میکروارگانیسمها 47

3-12 تعیین دورهی زمانی تولید بیوسورفکتانت… 48

3-13 نحوه اندازهگیری وزن خشک نمونهها 48

3-14 روشهای تعیین خصوصیات بیوسورفکتانتهای تولید شده و بررسی پتانسیل بیوسورفکتانتهای تولید شده در MEOR: 48

3-14-1 روش انهدام قطره روغن.. 48

3-14-2 روش شاخص امولسیون سازی.. 49

3-14-3 روش جابجایی روغن.. 49

3-14-4 روش CTAB آگار. 50

3-14-5 روش انحلال آنتراسن کریستالی.. 50

3-14-6 روشهای پایداری بیوسورفکتانت… 50

3-15 شناسایی سویههای تولید کننده بیوسورفکتانت… 51

3-15-1 شناسایی بیوشیمیایی.. 51

3-15-2 شناسایی مولکولی.. 53

3-16 اجزای PCR.. 57

3-16-1 انتخاب و تعیین آغازگرهای مناسب… 58

3-16-2 نحوه انجام PCR به منظور تکثیر ژن srDNA 16.. 59

3-16-3 بهینه سازی شرایط PCR.. 60

3-16-4 الکتروفورز محصولات PCR با استفاده از ژل آگارز 1% و ثبت تصاویر. 60

3-17 نرم افزارهای مورد استفاده در پژوهش…. 60

فصل چهارم: نتایج، بحث و پیشنهادها 61

4-1 شناسایی اسفنج مورد استفاده. 62

4-2 جداسازی میکرو ارگانیسمهای همزیست… 62

4-3 روشهای غربالگری جهت جداسازی میکروارگانیسمهای تولید کننده بیوسورفکتانت… 63

4-3-1 روش فعالیت همولیتیک… 63

4-3-2 روش تولید لیپاز. 64

4-3-3 روش آب گریزی سطح سلول.. 65

4-4 روشهای تعیین خصوصیات بیوسورفکتانت… 66

4-4-1 روش انهدام قطره روغن.. 66

4-4-2 روش شاخص امولسیون سازی.. 66

4-4-3 روش جابجایی روغن.. 67

4-4-4 روش CTAB آگار. 68

4-4-5 روش انحلال آنتراسن کریستالی.. 69

4-5 تعیین دورهی زمانی رشد میکروارگانیسمها 70

4-6 تعیین دورهی زمانی تولید بیوسورفکتانت… 72

4-7 روشهای پایداری بیوسورفکتانت… 73

4-8 شناسایی سویههای تولید کننده بیوسورفکتانت… 76

4-8-1 شناسایی بیوشیمیایی.. 76

4-8-2 شناسایی مولکولی.. 77

4-9 نتیجهی تکثیر ژل s rDNA16.. 80

4-10 بازسازی توالیهای s rDNA16.. 80

4-11 تشابه توالی به دست آمده با ژن s rDNA16 در NCBI. 84

4-12 محاسبه فاصله ژنتیکی توالیهای بدست آمده با مشابهترین گونهها 89

4-13 نتایج حاصل ازتعیین بهترین تطابقها 94

4-14 رسم درخت فیلوژنی.. 95

4-15 بحث و نتیجه گیری.. 98

4-15-1 شناسایی مولکولی.. 98

4-15-2 روشهای غربالگری جهت جداسازی میکروارگانیسمهای تولید کننده بیوسورفکتانت 99

4-15-3 روشهای تعیین خصوصیات بیوسورفکتانت… 101

4-15-4 روشهای پایداری.. 104

4-16 دورهی زمانی رشد و تولید بیوسورفکتانت… 106

4-17 نتیجهگیری نهايي.. 108

4-18پیشنهادات.. 110

منابع 111

فهرست جدول‌ها

جدول ‏3‑1: مواد مربوط به جداسازی و شناسایی میکروارگانیسمها 36

جدول ‏3‑2: مواد مربوط به روشهای مولکولی.. 37

جدول ‏3‑3: دستگاههای مورد استفاده. 38

جدول ‏3‑4: محیط کشت مارین آگار. 41

جدول ‏3‑5: مواد مورد استفاده در SDA.. 42

جدول ‏3‑6: ترکیب و مقدار مواد مورد استفاده در محیط کشت امرسون آگار. 42

جدول ‏3‑7: درصد انتخابی آگاروز بسته به اندازه قطعه DNA مورد نظر [101] 55

جدول ‏3‑8: توالی آغازگرها 58

جدول ‏3‑9: مواد مورد نیاز در واکنش srDNA 16.. 59

جدول ‏3‑10: برنامه بکار رفته در واکنش PCR برای تکثیر قطعات rDNA S16.. 59

جدول ‏4‑1 روش آب گریزی سطح سلول.. 65

جدول ‏4‑2 جذب سوسپانسیون میکروبی قبل و بعد از اضافه کردن فاز آب گریز. 65

جدول ‏4‑3: روش انهدام قطره. 66

جدول ‏4‑4: شاخص امولوسیون.. 66

جدول ‏4‑5: روش جابجایی روغن.. 67

جدول ‏4‑6: روش CTAB آگار. 68

جدول ‏4‑7: روش انحلال آنتراسن کریستالی.. 70

جدول ‏4‑8: نتایج روشهای بیوشمیایی.. 77

جدول ‏4‑9 : نسبت A260/A280. 77

جدول ‏4‑10: فاصلهی ژنتیکی سویهی شمارهی 1، با مشابهترین گونهها 89

جدول ‏4‑11: فاصلهی ژنتیکی سویهی شمارهی 2، با مشابهترین گونهها 90

جدول ‏4‑12: فاصلهی ژنتیکی سویهی شمارهی 3، با مشابهترین گونهها 91

جدول ‏4‑13: فاصلهی ژنتیکی سویهی شمارهی 4، با مشابهترین گونهها 91

جدول ‏4‑14: فاصلهی ژنتیکی سویهی شمارهی 5، با مشابهترین گونهها 92

جدول ‏4‑15: فاصلهی ژنتیکی سویهی شمارهی 6، با مشابهترین گونهها 92

جدول ‏4‑16: فاصلهی ژنتیکی سویهی شمارهی 7، با مشابهترین گونهها 93

جدول ‏4‑17: فاصلهی ژنتیکی سویهی شمارهی 8، با مشابهترین گونهها 93

جدول ‏4‑18: فاصلهی ژنتیکی سویههای جداسازی شده. 94

جدول ‏4‑19: نزدیک ترین سویههای پایگاه داده با توالی ژن srDNA 16 باکتریهای توالی یابی شده 94

فهرست شکل‌ها

شکل ‏1‑1: تصویری شماتیک از یک اسفنج [4] 4

شکل ‏1‑2: تصویری از یک اسفنج گوشتخوار (اسفنج چنگی) 8

شکل ‏1‑3: همزیستهای اسفنج در دو بخش درون و برون سلولی[42] 19

شکل ‏1‑4: شماتیک میسلی از یک نوع بیوسورفکتانت[49] 21

شکل ‏3‑1: موقعیت جزیرهی خارکو در کنار جزیره خارک… 39

شکل ‏3‑2: تهیهی محیط کشت مایع.. 47

شکل ‏3‑3: الگوی حرکتی مارکرهای مورد استفاده در این تحقیق.. 57

شکل ‏4‑1: تصاویری از اسفنج Halicona simulans. 62

شکل ‏4‑2: رشد میکروارگانیسمها در محیط کشت مارین آگار. 63

شکل ‏4‑3: روش همولیتیک: در این پلیت بلاد آگار فعالیت همولیتیک مشاهده میشود و مشاهدهی هالههای شفاف اطراف کلنیها وجود فعالیت همولیتیک را اثبات میکند. 64

شکل ‏4‑4: روش همولیتیک: در این پلیت بلاد آگار فعالیت همولیتیک مشاهده نشد و هالهی شفاف اطراف کلنی ها ایجاد نشده است. 64

شکل ‏4‑5: روش شاخص امولسیون سازی: در نمونه شاهد امولسیون مشاهده نشد در حالی که نمونه 3 دارای 65 درصد امولسیون میباشد و در دیگر نمونهها لایههای نازکی از امولسیون میباشند که نشان دهندهی وجود بیوسورفکتانت میباشد. 67

شکل ‏4‑6: در شکل الف) روش جابجایی روغن، مثبت میباشد. در شکل ب) روش جابجایی روغن منفی میباشد. 68

شکل ‏4‑7: روش CTAB آگار مثبت، در این شکل هالههای شفاف اطراف کلنی مشاهده
میشود. 69

شکل ‏4‑8: روش CTABآگار منفی، عدم تشکیل هاله شفاف مشاهده میشود. 69

شکل ‏4‑9: نمودارهای دورهی زمانی رشد با استفاده از OD.. 70

شکل ‏4‑10: نمودارهای دورهی زمانی رشد با استفاده از OD.. 71

شکل ‏4‑11: دورهی زمانی تولید بیوسورفکتانت… 72

شکل ‏4‑12: نمودارهای پایداری بیوسورفکتانت در غلظتهای مختلف NaCl 73

شکل ‏4‑13: نمودار پایداری بیوسورفکتانت در غلظتهای مختلف NaCl 74

شکل ‏4‑14: نمودارهای پایداری بیوسورفکتانت در محدودهی وسیعی از pH.. 74

شکل ‏4‑15: نمودارهای پایداری بیوسورفکتانت در محدودهی وسیعی از pH.. 75

شکل ‏4‑16: نمودار پایداری بیوسورفکتانت در دماهاي مختلف… 75

شکل ‏4‑17: نمودارهای پایداری بیوسورفکتانت در دماهاي مختلف… 76

شکل ‏4‑18: نمونههای DNA روی ژل آگاروز%1، در این شکل مارکر با حرف M مشخص شده است. اعداد 1 تا 8 به ترتیب نمونههای 1 تا 8 را نمایش میدهند. 78

شکل ‏4‑19: بهینه سازی محصولات PCR در 54 درجهی سانتیگراد. 79

شکل ‏4‑20: بهینه سازی محصولات PCR در غلظت 50 میکروگرم DNA، در این شکل به ترتیب از سمت چپ ابتدا مارکر که با حرف M مشخص شده و سپس از شمارهی 1 تا 8 به ترتیب از سمت چپ تا راست مشخص شده است. 79

شکل ‏4‑21: تصویر الکتروفورز محصولات PCR با استفاده از ژل آگارز 1%. M = مارکر. 80

شکل ‏4‑22: توالی سویهی Staphylococcus hominis DM122. 81

شکل ‏4‑23: توالی سویهی Aneurinibacillus miqulanus B0270. 81

شکل ‏4‑24: توالی سویهی Pseudomonas putida KT2440. 82

شکل ‏4‑25: توالی سویهی Providencia rettqeri DSM 4542. 82

شکل ‏4‑26: توالی سویهی Bacillus pumilus SAFR 032. 83

شکل ‏4‑27: توالی سویهی Jeotqalicoccus halotolerans YKJ 101. 83

شکل ‏4‑28: توالی سویهی 168 Bacillus subtilis. 84

شکل ‏4‑29: توالی سویهی Psychrobacter pacificensis P2K6. 84

شکل ‏4‑30: نتیجهی blast سویهی شمارهی1.. 85

شکل ‏4‑31 نتیجهی blast سویهی شمارهی2.. 86

شکل ‏4‑32: نتیجهی blast سویهی شمارهی3.. 86

شکل ‏4‑33: نتیجهی blast سویهی شمارهی4.. 87

شکل ‏4‑34: نتیجهی blast سویهی شمارهی5.. 87

شکل ‏4‑35: نتیجهی blast سویهی شمارهی6.. 88

شکل ‏4‑36: نتیجهی blast سویهی شمارهی7.. 88

شکل ‏4‑37 نتیجهی blast سویهی شمارهی8.. 89

شکل ‏4‑38: درخت فیلوژنی برای سویهی شماره 1.. 95

شکل ‏4‑39: درخت فیلوژنی برای سویهی شماره 2.. 95

شکل ‏4‑40: درخت فیلوژنی برای سویهی شماره 3.. 95

شکل ‏4‑41: درخت فیلوژنی برای سویهی شماره 4.. 96

شکل ‏4‑42: درخت فیلوژنی برای سویهی شماره 5.. 96

شکل ‏4‑43: درخت فیلوژنی برای سویهی شماره 6.. 96

شکل ‏4‑44: درخت فیلوژنی برای سویهی شماره 7.. 97

شکل ‏4‑45: درخت فیلوژنی برای سویهی شماره 8.. 97

شکل ‏4‑46: درخت فیلوژنی برای مقایسهی همهی سویههای جداسازی شده 97

امتیاز 0 از 5 از 0 دیدگاه

قیمت اصلی 45,000 تومان بود.قیمت فعلی 21,000 تومان است.

تاریخ ایجاد مهر 29, 1399
تاریخ بروزرسانی اسفند 13, 1401
فروش 0
دیدگاه 0

شرایط استفاده از محصول

تمام محصولات به ازای پرداخت پروژه تنها قابل استفاده می باشند. این بدین معنی است که برای استفاده از یک یا چند محصول ، لازم به خرید آن محصول است.

مزایای خرید این محصول:

دسترسی به فایل به صورت همیشگی
پشتیبانی رایگان
پشتیبانی 24 ساعته محصول
بازگشت وجه در صورت عدم رضایت مشتری

مشاهده قوانین سایت