%53تخفیف

تولید پروتئین HIV-1 Tat و تزریق آن به شتر به منظورتولید نانوبادی درمانی

تعداد 124صفحه در فایل word

چکیده

مقدمه: تولید عامل های درمانی برای درمانHIV-1 همچنان به عنوان یک چالش مطرح است، هدف از این مطالعه استخراج ژن VHH (نانوبادی) ازآنتی بادی شتری به منظور تولید نانوبادی درمانی علیه پروتئین HIV-1 Tat بود.HIV-1 برای همانندسازی نیازمند به پروتئین Tat می باشد.درمطالعات اخیر نشان داده شده که آنتی بادی خنثی کننده علیه Tat قابلیت مهار همانندسازی HIV-1 را دارد.

مواد و روش ها: در این مطالعه ژن سنتز شده Tat در وکتور pET28 a در E. coli بیان شد. سپس تخلیص پروتئین Tat-HIV1 از طریق ستون کروماتوگرافی صورت گرفت و پروتئین تخلیص شده به همراه ادجوانت فروند طی 5 نوبت به شتر تزریق گردید،RNA از لنفوسیت شتر استخراج و قطعات ژنی مربوط به VHH توسط RT-PCR و Nested-PCR از روی cDNA حاصل ساخته و تکثیر شدند.

نتایج: بیان باند 17کیلو دالتونی پروتئین Tatاز طریق SDS-PAGE و وسترن بلات تایید گردید. باند bp600 و باند bp400 ژن VHH از طریق PCRو Nested- PCR توسط الکتروفورز مشاهده گردید.

نتیجه گیری: نانوبادی ها می توانند به عنوان یک ابزار برای درمان HIV-1 باشند، نانوبادی ها به علت سایز کوچکشان قابلیت شناسایی اپی توپ های مخفی را دارند و این مساله منجر به خنثی سازی ویروس ها می شود.

کلمات کلیدی: آنتی بادی زنجیره سنگین،HIV-1 Tat ، نانوبادی، VHH

دسته: زیست شناسی, علوم تجربی برچسب: HIV-1 Tat, VHH, کلمات کلیدی: آنتی بادی زنجیره سنگین, نانوبادی

توضیحات

فهرست مطالب

مقدمه. 1

1-HIV-1. 2

1-1.تاریخچه HIV-1. 2

1-1-1. مورفولوژی HIV-1. 2

1-1-2 . ژنوم HIV-1. 3

1-2. مراحل پیشروی بیماری ایدز. 5

1-3.ژن (Transactivator transcription)HIV-1Tat. 6

1-3-1.اعمال HIV-1 Tat 7

1-3-1-1.رونویسی.. 7

1-3-1-2.القا آپوپتوز. 10

1-3-1-3.مهار آپوپتوز. 12

1-3-1-4.سرطان مرتبط با HIV-1. 13

1-3-1-5. سرکوب کردن سیستم ایمنی.. 14

1-3-1-6.اثر نوروتوکسیسیتی.. 14

1-4.درمان های مورد استفاده بر علیه HIV-1. 15

1-5.علل نیاز به درمان های دیگر علیه HIV-1. 18

1-6.آنتی بادی.. 20

1-6-1.ساختار آنتی بادی.. 20

1-6-2.منشا ژنتیکی آنتی بادی ها 23

1-7.آنتی بادی های استفاده شده بر علیه HIV-1. 24

1-8.آنتی بادی نوترکیب… 25

1-8-1.آنتی بادی های کایمری انسانی – موشی.. 27

1-8-2.قطعات کوچک آنتی بادی.. 28

1-8-3.آنتی بادی های چند ظرفیتی.. 28

1-8-4.آنتی بادی ها ی دارای عملکرد مختلف یا چندگانه. 29

1-8-5.آنتی بادی های درون سلولی(اینترابادی ها). 29

1-9.آنتی بادی های منوکلونال.. 30

1-9-1.آنتی بادی های منوکلونال شتری(نانوبادی). 31

1-9-1-1.مزایای به کارگیری نانوبادی.. 33

1-10.اهمیت انجام کار. 37

1-11.هدف پروژه. 38

مواد و روش ها 39

2-1. دستگاه ها و وسایل عمومي مورد نياز. 40

2-2. محيط‌هاي كشت باكتري.. 41

2-2-1.محيط LB (Louria-Bertani Medium) 41

2-2-2. محیط Ty2X.. 42

2-3. محلولها و بافرهای مورد نياز. 42

2-3-1. محلول IPTG.. 42

2-3-2 . محلولهاي مورد نياز جهت استخراج DNA پلاسميدي به روش ليز قليايي.. 42

2-3-2-1. محلول شماره 1 يا Sol I 42

2-3-2-2 . محلول شماره 2 يا Sol II 42

2-3-2-3 . محلول شماره 3 يا Sol III 43

2-3-3. بافر TE. 43

2-3-4 بافر فسفات سالين(PBS)150 ميلي مولار. 43

2-4. انتقال pET28 a_Tat به داخل باکتریDH5α E. coli مستعد شده. 43

2-4-1. روش تهيه باكتري مستعد 44

2-4-2. انتقال پلاسميد به درون باكتري به روش شوك حرارتي.. 45

2-4-3. روش استخراج و تخليص پلاسميد در مقياس كم.. 45

2-4-3-1. روش ليز قليايي.. 45

2-5. هضم آنزیمی وکتور(+) pET28a توسط آنزیم‌های EcoR5 و Xho1. 47

2-5-1.روش کار. 47

2-6 .الکتروفورز نمونه های هضم آنزیمی شده. 49

2-6-1. محلولها و بافرهاي مورد نياز. 49

2-6-1-1.بافر (x10) TBE. 49

2-6-1-2. بافر نمونه 6 درصد. 50

2-6-1-3.محلول اتيديوم برومايد 1 درصد. 50

2-6-2. ارزیابی پلاسمیدهای کلون شده. 51

2-7. انتقال پلاسمید pET28a_Tat به میزبان بیانیE. coli BL-21 DE3. 51

2-8. بیان پروتئین نوترکیب HIV -1 Tat. 51

2-8-1.مواد و وسایل مورد نیاز برای بیان پروتئین.. 51

2-8-2. بیان پروتئین نوترکیب HIV-1 Tat در مقیاس کم.. 53

2-9 .SDS-PAGE. 53

2-9-1.مواد و وسایل مورد نیاز. 54

2-9-2.روش تهیه محلول ها و بافرها 55

2-9-2-1 . محلول استوک آکریل آمید (8/30 درصد) 55

2-9-2-2. بافر ژل پایین.. 55

2-9-2-3. بافر ژل بالا. 55

2-9-2-4. بافر الکترود. 55

2-9-2-5. بافر نمونه(5X) 55

2-9-3.روش کار. 56

2-9-4-1. مواد و وسایل مورد نیاز. 56

2-9-4-2. روش تهیه محلول ها 57

2-9-4-2-1.محلول رنگ آمیزی.. 57

2-9-4-3. روش رنگ آمیزی.. 57

2-10.وسترن بلاتينگ….. 57

2-10-1.مواد و وسايل مورد نياز. 59

2-10-2. روش كار. 60

2-11.بیان پروتئین نوترکیبHIV-1 Tat در مقیاس بالا.. 60

2-11-1.مواد و وسایل مورد نیاز. 60

2-11-2.روش کار. 61

2-12. بافرهای مورد نياز برای تخلیص پروتئین.. 63

2-12-1 .تخليص آنتي ژن بيان شده با ستون رزين Ni-NTA.. 64

2-12-2.استخراج پروتئین نوترکیب HIV-1 Tat. 65

2-12-3.آماده سازي نمونه. 65

2-13. رزين Ni-NTA.. 66

2-13-1. آماده سازي و به تعادل رساندن رزين.. 66

2-13-2. مجاورت نمونه و رزين.. 66

2-14-.بهينه سازي تخليص….. 67

2-14-1. شستشوي رزين.. 67

2-14-2. شويش رزين.. 68

2-14-3.جمع آوري رزين.. 68

2-14-4.بازيابي ستون از پروتئين هاي مزاحم.. 68

2-14-5.شارژ رزين.. 69

2-15.بررسي پروتئين نوترکيب HIV-1 Tat تخليص شده با روش SDS-PAGE. 69

2-16.لیوفیلیزه. 69

2-17. ایمن سازی شتر. 70

2-17-1. شترهای مورد استفاده. 70

2-17-2.روش کار ایمن سازی شتر. 70

2-17-3.ادجوانت فروند.. 70

2-17-3-1.نقش ادجوانت ها 71

2-18.خون گیری و جداسازی لنفوسیت ها 71

2-19. تکثیر ژن نانوبادی.. 73

2-19-1.استخراجRNA ‌ از لنفوسیت های تحریک شده با آنتی ژن HIV-1 Tatو تهیه cDNA.. 73

2-20. طراحی پرایمرها 75

2-21.تکثیر ِژن آنتی بادی های زنجیره سنگین(PCR-1 ). 76

2-21-1. تخلیص ژن آنتی بادی های زنجیره سنگین شتری از ژل آگارزPCR-1(PCR P1). 77

2-21-2.روش کار. 78

2-22. تکثیر ِژن آنتی بادی های زنجیره سنگین(PCR-2 ). 79

2-22-1.تخلیص محصول PCR -2 (PCR P2). 80

نتایج.. 81

3-1 . نتیجه حاصل از هضم آنزیمی وکتور pET28a(+) با استفاده از آنزیم‌های EcoR5 وXhoI 82

3-2 . نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HIV-1 Tat با روش SDS-PAGE.. 83

3-3 .نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HIV-1 Tat با روش وسترن بلاتینگ….. 84

3-4. نتایج تخلیص پروتئین نوترکیب HIV-1 Tat با روش SDS-PAGE.. 85

3-5.نتایج تکثیر ژن نانوبادی.. 88

3-5-1.نتیجه تکثیر PCR اول.. 89

3-5-2. نتیجه تکثیر PCR دوم. 90

بحث… 92

4-1. بررسی ضرورت انجام تحقیق.. 93

4-2.آنتی بادی منوکلونال شتری.. 95

4-3.مطالعات انجام شده بر روی سایر پروتئین های HIV-1. 97

4-4. مطالعات مشابه. 99

4-5.نتیجه گیری.. 102

4-6.پیشنهادات… 103

فهرست منابع و مآخذ.. 104

فهرست جدول ها

جدول 1-1. آنتی بادی های انسانی شده. 27

جدول 1-2. مزایاي آنتی بادي نوترکیب شتري درمقایسه باآنتی بادیهاي مونوکلونال.. 35

جدول 1-3. مثالهایی ازکاربردهاي دارویی- درمانی آنتی بادي نوترکیب شتري.. 36

جدول 2-1.مواد مورد نیاز برای هضم آنزیمی وکتور(+) pET28a توسط آنزیم‌های ECOR5 و Xho1. 48

جدول2-2. لیست و مقدار مخلوط واکنش PCR اول.. 76

جدول 2-3 .برنامه ترموسایکلر جهت انجام PCR مرحله اول.. 77

جدول 2-4. لیست و مقدار مخلوط واکنش PCR دوم. 79

جدول 2-5.برنامه ترموسایکلر جهت انجام PCR مرحله دوم. 80

فهرست شکل ها

شکل1-1. ساختارHIV-1. 3

شکل 1-2. ژنوم HIV-1. 5

شکل1-3 . ژنوم HIV-1 و پروموتر HIV-1. 8

شکل 1-4. حلقه سه تایی Cyclin T1,Tatو cdk-9. 10

شکل 1-5.انواع آنتی بادی های نوترکیب… 26

شکل2-1. ساختمان پلاسمید pET-28a(+) 47

شکل 3-1.برش آنزيمي وکتور(+)pET28a.. 82

شکل 3-2 . ژل مربوط بهSDS-PAGE 15درصد ، نمونه های قبل و بعد از القا 84

شکل 3-3 . وسترن بلاتینگ پروتئین Tat. 85

شکل 3-4 : ژل SDS-PAGE 15 درصد مربوط به خروجی های ستون تخلیص….. 88

شکل 3-5. الکتروفورز محصول PCR انجام شده توسط پرایمرهای CALL001 و CALL002 . 90

شکل 3-6. الکتروفورز محصول PCR انجام شده توسط پرایمرهای P38 و AGE . 91

امتیاز 0 از 5 از 0 دیدگاه

قیمت اصلی 45,000 تومان بود.قیمت فعلی 21,000 تومان است.

تاریخ ایجاد مهر 28, 1399
تاریخ بروزرسانی اسفند 13, 1401
فروش 0
دیدگاه 0

شرایط استفاده از محصول

تمام محصولات به ازای پرداخت پروژه تنها قابل استفاده می باشند. این بدین معنی است که برای استفاده از یک یا چند محصول ، لازم به خرید آن محصول است.

مزایای خرید این محصول:

دسترسی به فایل به صورت همیشگی
پشتیبانی رایگان
پشتیبانی 24 ساعته محصول
بازگشت وجه در صورت عدم رضایت مشتری

مشاهده قوانین سایت