%53تخفیف

تهیه و تولید باکتری نوترکیب (ترانسژن) بیان کننده ژن انسانی کلاژناز۳ (MMP13)

تعداد 35صفحه در فایل word

چکیده

هدف: ماتریکس متالو پروتئینازها [1]یا ماتریکسین ها (MMPs) ، گروهی از آنزیمهای ماتریکس خارج سلولی هستند که وظیفه هضم انواع پروتئینهای موجود در فضای بین سلولی را بر عهده دارند و نقش آنها درمراحل مختلف سرطان مانند تکثیر سلولی[2]، آنژیوژنز[3]،آپوپتوز[4]، تبدیل سلولهای اپتیلیال به مزانشیمال(EMT) بخوبی شناخته شده است. سرطانهای مجرای گوارشی [5]دیسپلازیهای بدخیمی هستند که قادرند تمامی مجرای گوارشی را در هر ناحیه ای از مری، معده، پانکراس، روده کوچک، کلون و رکتوم درگیر نمایند.به علت ماهیت پیشرونده تنها تشخیص زودرس و درمان مناسب می تواند شانس بقای مبتلایان را افزایش دهد .ارزیابی بیان سرمی ژن انسانی کلاژناز۳ (MMP13) در بیماران مبتلابه سرطان مری بطور معنی داری افزایش میزان MMP13 سرمی را نشان داده است. با توجه به اهمیت این ژن ها در فرایند های سلولی و نیز کاربرد موثر آنها در امر درمان سرطان، فرایند کلونینگ، بیان این ژن به صورت ectopic expression و بررسی عملکرد دقیق این ژن از اهمیت پایه ای برخوردارمی باشد. امید است در آینده بتوانیم با تولید انتی بادی مونوکلونال برعلیه MMP13 ، کیت الایزای مربوط به این پروتئین را تولید کنیم. شاید که بدینوسیله با شناسایی زود هنگام بیماری در مراحل اولیه بتوانیم در بخش درمان زودرس اقدام نموده و از این طریق میزان بقاء بیماران را افزایش دهیم.

روش کار: پس از سنتز cDNA از نمونه RNA بافت تومور بیمار مبتلا به سرطان مری، توسط واکنش
PCR RT_ و با پرایمرهای طراحی شده، توالی مورد نظر از ژن (MMP13) تکثیر یافت. پس از انجام خالص سازی [6] ،قطعه تکثیرشده و پلاسمید بیانی PET21(b)+ توسط آنزیم های محدوالاثرHINDIII وXho1 برش خورده و کلونینگ قطعه مورد نظر به داخل پلاسمید انجام شد. جهت بررسی انتقال ژن به شکل صحیح و توالی ژن، پلاسمید نوترکیب توسط روش تعیین توالی مورد ارزیابی قرار گرفت. به منظور تکثیر پلازمید ، وکتور پلازمیدی حاوی ژن (MMP13) به باکتری TOP10 انتقال داده شد و پس از استخراج، پلازمید موردنظر به باکتری BL21 منتقل شد تا مراحل تولید پروتئین در آن صورت گیرد. در نهایت میزان و صحت بیان توسط روش وسترن بلات[7] مورد بررسی قرار گرفت.

نتیجه گیری: با توجه به نتایج بدست آمده،این قطعه ژنی توانایی کلون شدن در میزبان پروکاریوتی را دارا بوده و باکتری قادر است به کمک القاگر مناسب به میزان فراوانی پروتئین مورد نظر را تولید کند. از این جهت می توان از این پروتئین نوترکیب برای تهیه کیت تشخیصی سرطان مری به واسطه تکنیک الایزا استفاده برد. همچنین می توان با تزریق این پروتئین نوترکیب به عنوان واکسن، سیستم ایمنی فرد را جهت پیش گیری از ابتلا به سرطان تقویت نمود.

کلمات کلیدی: MMP13 ، PET21(b)+ ، BL21، وکتورپلازمدی ، TOP10

[1] Matrix Metalloproteinases

[2] Cell proliferation

[3] Angiogenesis

[4] Apoptosis

[5] Gastrointestinal

[6] purofocation

[7] Western Blotting

دسته: زیست شناسی, علوم تجربی برچسب: BL21, PET21(b)+, TOP10, کلمات کلیدی: MMP13, وکتورپلازمدی

توضیحات

فهرست مطالب

چکیده 5

فصل اول: کلیات تحقیق.. 7

1-1- سرطان. 8

1-1-1- سرطان مری.. 8

1-1-2- وضعیت سرطان مری در ایران. 9

1-1-3- میزان مرگ و میر. 10

1-2- انواع سرطان مری از نظر هیستوپاتولوژی.. 10

1-2-1- پاتولوژی.. 11

1-2-3- اپیدمیولوژی.. 12

1-2-4- مورفولوژی و موقعيت آناتوميکال. 12

1-2-5- پاتوژنز. 13

1-3- سیر بالینی سرطان مری.. 13

1-3-1- غربالگری به منظور تشخیص زودرس…. 14

1-3-2- عوامل خطر زا در ابتلا به سرطان مری.. 15

1-4- روشهای تشخیصی.. 15

1-4-1- اندوسکوپی اولترا سوند (EUS) 15

1-5- روشهای درمان. 16

1-6- ماتریکس متالو پروتئازها 17

1-6-1- عملکردهای زیستی ماتریکس متالوپروتئینازها 18

1-6-2- ساختار پروتئینی ماتریکس متالوپروتئینازها 20

1-6-3- طبقه بندی ماتریکس متالوپروتئینازها 22

1-6-4- سوبستراهای آنزیمی.. 24

1-7- تنظیم فعالیت ماتریکس متالوپروتئینازها 25

1-7-1- تنظیم در سطح بیان ژن. 26

1-7-2- تنظیم از طریق فعالسازی پرو-آنزیم غیر فعال. 27

1-7-3- تنظیم توسط مهارکننده های بافتی.. 27

1-7-4- تنظیم از طریق بخش بندی.. 28

1-7-5- نقش ماتریکس متالوپروتئینازها در تغییرات سرطانی.. 28

1-7-6- نقش ماتریکس متالوپروتئینازها در تکثیر سلولی.. 29

1-7-7- نقش ماتریکس متالوپروتئینازها در رگ زایی 30

1-7-8- نقش ماتریکس متالوپروتئینازها در مرگ سلولی برنامه ریزی شده 31

1-7-9- نقش ماتریکس متالوپروتئینازها در تبدیل سلولهای اپتیلیال به مزانشیمال. 32

1-8- همسانه سازی ژن. 32

1-8-1 وکتور pET.. 34

1-8-2- اندونوکلئازهای محدود کننده 36

1-9- واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR ) 38

1-9-1- آنزیم Taq پلیمراز : 39

1-9-2- آنزیم Pfu پلیمراز: 39

1-10- انتقال ژن. 40

1-10-1- پیشرفت های اولیه در زمینه انتقال ژن. 40

1-10-2- میزبان کلونینگ…. 42

1-10-2-1- سویه 10E.coli TOP.. 44

1-10-3- آشنایی با اپران lac در باکتری E.coli 45

1-11- غربالگری وجود ژن. 48

1-12- بیان پروتئین.. 48

1-13- وسترن بلات 50

1-13-1- تاریخچه بلاتینگ…. 50

1-13-2- مزایای بلاتینگ…. 51

1-13-3- انتقال پروتئین ها از ژل به غشا 51

1-13-4- انواع غشاهای مورد استفاده در پروتئین بلاتینگ…. 52

1-13-4-1- نیتروسلولوز. 52

1-13-4-2- پلی‌وینیلیدین دی‌‌فلوراید (PVDF) 53

1-13-4-3- کاغذهای فعال شده (گروه‌های دیازو) 53

1-13-4-4- غشاهای نایلونی فعال شده 53

1-14- روش‌های انتقال پروتئین‌ از ژل به غشا 54

1-14-1- انتقال به کمک پدیده انتشار. 54

1-14-2- جریان حلال وابسته به خلأ.. 54

1-14-3- الکترو بلاتینگ…. 55

1-15- انواع الکتروبلاتینگ…. 55

1-15-1- انتقال مرطوب… 55

1-15-2- انتقال نیمه‌خشک یا افقی 56

1-16- عوامل موثر در انتقال پروتئینها ار ژل به غشا 56

1-17- انواع روشهای تشخیصی.. 57

1-18- کاربرد های دیگر وسترن بلات در تحقیقات علمی.. 59

1-19- مسأله ی تحقیق.. 59

1-20- فرضیه تحقیق.. 60

فصل دوم: پیشینه تحقیق.. 61

2-1- پیشینه تحقیق.. 62

2-1-1- ماتریکس متالوپروتئینازها و سرطانهای مجرای گوارشی.. 62

2-1-2- نقش ماتریکس متالوپروتئینازها در سرطان مری.. 63

2-1-3- بررسی اختصاصی ماتریکس متالوپروتئینازهای -۱۳ در انواع مختلف سرطان. 65

فصل سوم: مواد و روش ها 68

3-1- روش کار. 64

3-2- شناسایی ژن. 65

3-2-1- طراحی پرایمرها 65

3-2-2- ساخت cDNA از RNA… 66

3-2-3- PCR با آنزیم Pfu پلیمراز. 69

3-2-4- الکتروفورزDNA… 70

3-2-4-1- تهیه ژل آگارز و بررسی قطعه ژنی.. 71

3-2-4-2- تهیه ژل آگارز. 72

3-2-5- استخراج محصول واکنش PCRاز ژل آگاروز. 73

3-2-6- تعیین کیفیت و مقدار محصول PCR خالص شده از ژل. 74

3-3- برش آنزیمی ژن مورد نظر به روش برش مضاعف…. 75

3-3-1- استخراج DNA برش خورده از مایع.. 75

3-4- کشت باکتری E. coli به منظور آماده سازی برای استخراج پلاسمید pET-21b(+) 75

3-4-1- تهیه محیط کشت LB مایع.. 76

3-4-2- تهیه محیط کشت LB-آگار. 76

3-4-3- تهیه آمپی سیلین mg/ml100.. 77

3-4-4- تهیه محیط کشت انتخابی LB-آگار حاوی آمپی‌سیلین.. 77

3-5- استخراج پلاسمید(+) pET-21bاز باکتری E.Coli، TOP10. 77

3-5-1- برش مضاعف پلاسمید توسط آنزیمهای Xho I و HindIII. 79

3-5-2- استخراج پلاسمید برش خورده 80

3-6- واکنش ادغام پلاسمید و قطعه مورد نظر. 80

3-7- ترانسفورماسیون. 81

3-7-1 مستعد نمودن باکتری TOP10. 81

3-7-2- ترانسفورماسیون محصول لایگیشن به سلول های شایسته TOP10 E.coli با روش شوک حرارتی.. 82

3-7-3- PCR با پرایمرهای T7 جهت غربالگری کلنی های رشد یافته از نظر وجود پلاسمید نوترکیب… 83

3-7-4- استخراج و خالص سازی پلاسمید کلون شده از باکتری TOP10. 85

3-8- تایین توالی.. 86

3-9- انتقال پلاسمید استخراج شده از باکتری TOP10، بداخل باکتری E.coli BL21(DE3) 86

3-9-1- القاء بیان پروتئین به کمک IPTG… 87

3-9-2- لیز باکتری.. 88

3-10- آنالیز پروتئین بیان شده به روش SDS-PAGE.. 89

3-10-1- ماده سازی نمونه و مارکر. 91

3-10-2- آماده سازی محلول رنگ امیزی و رنگ بری.. 92

3-11- وسترن بلات… 92

3-11-1- غشای مورد استفاده در وسترن بلاتینگ…. 93

3-11-2- دستگاه الکتروبلاتینگ…. 93

3-11-3- رنگ آمیزی غشا 95

3-11-4- پوشانیدن محلهای خالی غشا(بلاکینگ) 95

3-11-5- اضافه کردن آنتی بادی اولیه 96

3-11-6- اضافه کردن آنتی بادی ثانویه اختصاصی گونه 96

3-11-7 تشخیص نهایی.. 97

فصل چهارم: نتایج و بحث… 98

4-1- توالی CDNA قطعه هدف MMP13 انسانی، برگرفته از سایت NCBI (355 نوکلئوتید) 98

4-1-1- توالی آمینواسیدی MMP13 انسانی و موشی، برگرفته از سایت NCBI. 98

4-1-2- طراحی پرایمرها 99

4-2- سنتز cDNA و انجام PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی به منظور تکثیر ژن مورد نظر. 99

4-2-1- PCR با آنزیم Pfu پلیمراز. 100

4-3- الکتروفورز پس از برش مضاعف قطعه ژنی مورد نظر با دو انزیم Xho I و HindIII. 101

4-4- استخراج پلاسمید(+)pET-21b از باکتری E.Coli، TOP10. 101

4-4-1- استخراج و خالص سازی پلاسمید از ژل پس ازبرش مضاعف توسط آنزیمهای Xho I و HindIII. 102

4-5- PCR با پرایمرهای T7 جهت غربالگری کلنی های رشد یافته از نظر وجود پلاسمید نوترکیب… 103

4-5-1- الکتروفورز محصول حاصل از PCR با پرایمر T7. 105

4-6- استخراج و خالص سازی پلاسمید نوترکیب pet-21b از باکتری TOP10. 105

4-7- نتایج تعیین توالی.. 106

4-8- کشت باکتری E.coli BL21(DE3) بمنظور اطمینان از عدم الودگی.. 107

4-8-1- انتقال پلاسمید استخراج شده از باکتری TOP10، بداخل باکتری E.coli BL21(DE3) 107

4-8-2- القاء بیان پروتئین به کمک IPTG و تائید بیان ان به کمک تکنیک SDS-page. 108

4-9- ایمونوبلاتینگ (وسترن بلات) 108

فصل پنجم: نتیجه گیری.. 110

5-1- بحث… 112

5-2- نتیجه گیری.. 120

5-3- پیشنهاد برای تحقیقات آینده 120

References. 120

فهرست شکل ها

شکل ‏1‑1: بخشهای مختلف ساختاری در مهمترین ماتریکس متالوپروتئینازها (Nagase, و غيره, 1999) (Jones, و غيره, 2003). 22

شکل ‏1‑2سطوح تنظیم فعالیت ماتریکس متالوپروتئینازها (Bergam, و غيره, 2003) (Yan, و غيره, 2007) 26

شکل ‏1‑3: تصویر شماتیک Pet21-b(+) به همراه جایگاه های برش آنزیم های محدود الاثر. 35

شکل ‏1‑4: تصویر شماتیک توالی¬های مشترک ناحیه کلونینگ و بیان در pET21a-d(+) 35

شکل ‏1‑5: ساختار ژنی اپران lac. 46

شکل ‏1‑6 :نحوه عملکرد IPTG در اپران lac. 47

شکل ‏3‑1: دستگاه ترموسایکلر ساخت شرکت پرکین المر ایالات متحده امریکا 67

شکل ‏3‑2: تانک الکتروفورز و دستگاه مولد ولتاژ. 71

شکل ‏3‑3: دستگاه تصویر ساز ژل ساخت شرکت سینژن انگلستان. 71

شکل ‏3‑4: شیکرانکوباتور ساخت شرکت ان بی اس ایالات متحده امریکا 76

شکل ‏3‑5: کیت استخراج پلاسمید فرمنتاز. 77

شکل ‏3‑6: مینی سانتریفیوژ ساخت شرکت اپندورف المان. 79

شکل ‏3‑7: بن ماری ساخت شرکت ممرت ایالات متحده امریکا 83

شکل ‏3‑8: دستگاه اولتراسوند. 89

شکل ‏3‑9: کیت سوبسترای کمی لومینانس شرکت پارس توس…. 97

شکل ‏4‑1: الکتروفورز محصول PCR نمونه ۱ قطعه۳۵۵ جفت بازی .نمونه ۲ negativ control . روی ژل آگارز۲% با رنگ آمیزی ا Green viewer. Lبه همراه شاخص وزن مولکولی ۱۰۰ جفت باز. 100

شکل ‏4‑2: الکتروفورز محصول PCR با پلیمراز Pfu قطعه۳۵۵ جفت بازی روی ژل آگارز۲% با رنگ آمیزی Green viewer. L به همراه شاخص وزن مولکولی ۱۰۰ جفت باز. 100

شکل ‏4‑3: الکتروفورز محصول برش مضاعف آنزیمی قطعه۳۵۵ جفت بازی روی ژل آگارز ۵/۱% با رنگ آمیزی ا Green viewer. Lبه همراه شاخص وزن مولکولی ۱۰۰ جفت باز. 101

شکل ‏4‑4: الکتروفورز پلازمید (+) pET-21b استخراج شده از باکتری E.Coli، TOP10 ،روی ژل آگارز ۱٪. L شاخص وزن مولکولی ۱۰۰ جفت باز، نمونه شماره ۱ پلاسمید pET21b(+) 102

شکل ‏4‑5: الکتروفورز محصول استخراج و خالص سازی پلاسمید از ژل پس ازبرش مضاعف ،روی ژل آگارز۱% با رنگ آمیزی ا Green viewer. نمونه شماره ۱ محصول پلازمید استخراج شده قبل از برش مضاعف، ،و نمونه شماره ۲ محصول مونوکات با انزیم Xho I . نمونه ۳ محصول مونو کات با انزیم Hi 103

شکل ‏4‑6: تصویر مربوط به پلیت شماره گذاری شده برای PCR.. 104

شکل ‏4‑7: شرایط واکنش PCR با پرایمر T7 در دستگاه ترموسایکلر. 104

شکل ‏4‑8: الکتروفورز محصول PCR با پرایمر T7، روی ژل آگارز 5/1 درصد. L شاخص وزن مولکولی 100 جفت باز و نمونه 1و2و3 توالی مورد نظر از ژن MMP13 (355 نوکلئوتید) را دریافت نکردهاند.نمونه 4و 5 توالی مورد نظر از ژن MMP13 (355 نوکلئوتید) را دریافت کرده اند. 105

شکل ‏4‑9: الکتروفورز محصول استخراج و خالص سازی پلاسمید pet-21b از باکتری TOP10 ،روی ژل آگارز1% با رنگ آمیزی ا Green viewer. نمونه شماره 1و2 محصول پلازمید استخراج شده از کلنی شماره 4 و5. L شاخص وزن مولکولی 1kbp . 106

شکل ‏4‑10 نتایج حاصل از بلاست پروتئین تعیین توالی شده 106

شکل ‏4‑11:عدم رشد باکتری (E.coli BL21(DE3 در محیط کشت امپی سیلین دار. 107

شکل ‏4‑12: رشد باکتری (E.coli BL21(DE3 در محیط کشت امپی سیلین داربه معنای دریافت پلازمید (+)pET-21b توسط E.coli BL21(DE3)است. 107

شکل ‏4‑13:پروتئین نووترکیب MMP13 انسانی بر روی SDS-page ۱۵ درصد با رنگ امیزی کوماسی بلو نشان داده شده است. 108

شکل ‏4‑14: نتیجه وستری بلات. L مارکر. 109

شکل ‏5‑1: عوامل کنترل کننده ی سیستم. 116

فهرست جدولها

جدول ‏1‑1: فرآیندهای فیزولوژیکی و پاتولوژیکی که با دخالت ماتریکس متالوپروتئینازها انجام می گیرد (Jurasz, et al., 2002). 20

جدول ‏1‑2: هشت گروه بزرگ ماتریکسین ها، زیر گروه های آنها و جایگاه کروموزومی ژنهای کدکننده هر کدام (Mannello, et al., 2006) (Egeblad, et al., 2002) . 23

جدول ‏1‑3: سوبستراهای هدف در ماتریکس خارج سلولی (Yoon, et al., 2003) 24

جدول ‏1‑4: حداکثر طول قطعه DNA وارد شده با وکتور های مختلف کلونینگ (Primrose, et al., 2002) 36

جدول ‏1‑5 کلاس های اصلی اندونوکلئاز های محدودکننده 38

جدول ‏3‑1: پرایمر های طراحی شده توسط نرم افزارPrimer3. 66

جدول ‏3‑2: تنظیمات دستگاه ترموسایکلر برای ساخت cDNA… 66

جدول ‏3‑3: مواد مخلوط شده برای انجام واکنش PCR.. 68

جدول ‏3‑4: شرایط دمایی دستگاه ترموسایکلربرای PCR با پلیمرازTag. 68

جدول ‏3‑5: شرایط انجام PCR با آنزیم Pfu پلیمراز. 69

جدول ‏3‑6: شرایط دمایی دستگاه ترموسایکلربرای PCR با پلیمراز pfu. 70

جدول ‏3‑7: مواد مورد نیاز برای تهیه بافرX 1 TAE.. 72

جدول ‏3‑8: محتویات بافر نمونه گذاری.. 73

جدول ‏3‑9: محتوی واکنش برش آنزیمی محصول خالص شده PCR با Xho I , HindIII. 79

جدول ‏3‑10: مقادیر مواد واکنش ادغام (لیگاسیون) 81

جدول ‏3‑11: مقادیر واکنش PCR با استفاده از پرایمر T7. 84

جدول ‏3‑12: نمونه ای از شرایط واکنش PCR با پرایمر T7 در دستگاه ترموسایکلر. 84

جدول ‏3‑13: تنظیمات دستگاه اولترا سوند پراب دار. 88

جدول ‏3‑14: مواد مورد نیاز ژل ۱۵٪ جداکننده 90

جدول ‏3‑15: مواد مورد نیاز ژل ۵٪ متراکم کننده 91

جدول ‏3‑16: محتویات بافر نمونه2X… 91

جدول ‏3‑17: محتویات محلول رنگ امیزی در حجم 50 ml 92

جدول ‏3‑18: محتویات محلول رنگ بری در حجم 50 ml 92

جدول ‏3‑19: محتویات بافر ترنسفر وسترن بلات… 94

جدول ‏3‑20: دستور تهیه PBS (بافر فسفات نمکی) 95

امتیاز 0 از 5 از 0 دیدگاه

قیمت اصلی 45,000 تومان بود.قیمت فعلی 21,000 تومان است.

تاریخ ایجاد مهر 28, 1399
تاریخ بروزرسانی اسفند 13, 1401
فروش 0
دیدگاه 0

شرایط استفاده از محصول

تمام محصولات به ازای پرداخت پروژه تنها قابل استفاده می باشند. این بدین معنی است که برای استفاده از یک یا چند محصول ، لازم به خرید آن محصول است.

مزایای خرید این محصول:

دسترسی به فایل به صورت همیشگی
پشتیبانی رایگان
پشتیبانی 24 ساعته محصول
بازگشت وجه در صورت عدم رضایت مشتری

مشاهده قوانین سایت