تهيه آنتی بادی نوترکيب scFv بر عليه پروتئين سطحی توکسوپلاسما گوندی

 

عنوان                                                                                     صفحه

فصل اول:مقدمه وهدف

مقدمه و هدف…………………………………………………………………………………………………………………………………………….2

فصل دوم:کليات و مروری بر منابع

1-2 تعريف آنتی بادي ها……………………………………………………………………………………………………………………………..7

2-2 ساختمان و ويژگی های کلی آنتی بادی ها…………………………………………………………………………………………………8

3-2 انواع آنتی بادی ها…………………………………………………………………………………………………………………………………9

4-2 آنتی بادی های نوترکيب………………………………………………………………………………………………………………………11

5-2 بيان آنتی بادی های نوترکيب در سلول باکتری اشريشياکلی………………………………………………………………………..14

6-2 بيان آنتی بادی روی سطح فاژ………………………………………………………………………………………………………………..14

7-2 روند جداسازی فاژ آنتی بادی ها……………………………………………………………………………………………………………16

8-2 غربالگری فاژ آنتی بادی های جداشده…………………………………………………………………………………………………….19

9-2 کتابخانه های فاژی تاملينسون I و J………………………………………………………………………………………………………..20

10-2 کاربرد کتابخانه های تاملينسون I و J…………………………………………………………………………………………………….23

11-2 استفاده از آنتی بادی های نوترکيب در تشخيص آنتی ژن ها……………………………………………………………………..23

12-2 بيماری توکسوپلاسموز………………………………………………………………………………………………………………………24

1-12-2 بيماری در انسان……………………………………………………………………………………………………………………………25

1-1-12-2 توکسوپلاسموز اکتسابی……………………………………………………………………………………………………………..25

2-1-12-2 توکسوپلاسموز چشمی……………………………………………………………………………………………………………….25

3-1-12-2 توکسوپلاسموز مادرزادی…………………………………………………………………………………………………………..26

4-1-12-2 توکسوپلاسموز در ميزبان مبتلا به اختلال ايمنی……………………………………………………………………………….26

2-12-2 بيماری در حيوانات………………………………………………………………………………………………………………………..26

1-2-12-2 نشانه های بالينی در گربه…………………………………………………………………………………………………………….27

2-2-12-2 نشانه های بالينی در سگ…………………………………………………………………………………………………………….27

13-2 انگل توکسوپلاسما گوندئی………………………………………………………………………………………………………………..27

1-13-2 فرم تروفوزوئيت……………………………………………………………………………………………………………………………27

2-13-2 فرم کيست…………………………………………………………………………………………………………………………………..28

3-13-2 فرم اواوسيت………………………………………………………………………………………………………………………………..28

14-2 چرخه زندگی…………………………………………………………………………………………………………………………………..29

15-2 پاتوژنز…………………………………………………………………………………………………………………………………………….31

16-2 روش انتقال بيماری……………………………………………………………………………………………………………………………32

17-2 پيشگيری…………………………………………………………………………………………………………………………………………32

18-2 تشخيص بيماری………………………………………………………………………………………………………………………………..33

فصل سوم: مواد و روش کار

1-3 جداسازی آنتی بادی های اختصاصی………………………………………………………………………………………………………37

2-3 رشد دادن ليبراری های تاملينسون I و J…………………………………………………………………………………………………..37

3-3 تهيه ذخيره ثانويه از ليبراری ها……………………………………………………………………………………………………………….38

4-3 اندازه گيری تيتر فاژ ليبراری های تاملينسون I و J……………………………………………………………………………………..38

5-3 مراحل جداسازی فاژ آنتی بادی های مناسب…………………………………………………………………………………………….39

1-5-3 دور اول جداسازی…………………………………………………………………………………………………………………………..39

2-5-3 تعيين تيتر فاژهای رهاسازی شده………………………………………………………………………………………………………..40

3-5-3 بازيابی فاژهای جداسازی شده در دور اول جداسازی…………………………………………………………………………….41

4-5-3 دور دوم جداسازی………………………………………………………………………………………………………………………….42

5-5-3 دور سوم جداسازی………………………………………………………………………………………………………………………….42

6-3 توليد قطعات آنتی بادی  scFvمحلول……………………………………………………………………………………………………43

7-3 بيان آنتی بادی های محلول scFv………………………………………………………………………………………………………….43

8-3 غربالگری با استفاده از آزمايش مونوکلونال الايزا……………………………………………………………………………………..44

9-3 آزمايش الايزای تکميلی………………………………………………………………………………………………………………………46

10-3 آزمايش Dot blotting…………………………………………………………………………………………………………………..46

1-10-3 آماده سازی آنتی بادی های محلول…………………………………………………………………………………………………..46

2-10-3 انجام آزمايش Dot blotting……………………………………………………………………………………………………….47

11-3 الکتروفورز ژل پلی اکريل آميد-SDS…………………………………………………………………………………………………48

12-3 مراحل آماده سازی قالب مخصوص ژل وانجام الکتروفورز……………………………………………………………………….48

13-3 آشکار سازی آنتی ژن توکسوپلاسما در ژل SDS-PAGE…………………………………………………………………….51

14-3 آزمايش وسترن بلات…………………………………………………………………………………………………………………………51

1-14-3 روش انجام آزمايش………………………………………………………………………………………………………………………51

15-3 ارزيابی کلون های انتخابی از لحاظ داشتن ژن scFv با روش PCR………………………………………………………….53

1-15-3 استخراج پلاسميد با استفاده از کيت………………………………………………………………………………………………….54

2-15-3 انجام آزمايش PCR……………………………………………………………………………………………………………………..55

16-3 الکتروفورز ژل آگارز………………………………………………………………………………………………………………………..57

فصل چهارم: نتايج

1-4 اندازه گيری تيتر فاژ کتابخانه های I و J تاملينسون…………………………………………………………………………………….59

2-4 دورهای اول، دوم و سوم جداسازی………………………………………………………………………………………………………..59

3-4 غربالگری کلون های جداسازی شده از دور دوم و سوم با استفاده از آزمايش مونوکلونال الايزا…………………………61

4-4 آزمايش الايزا برای ارزيابی فعاليت آنتی بادی های انتخاب شده نسبت به شناخت آنتی ژن توکسوپلاسما گوندئی، شير خشک بدون چربی و پروتئين BSA……………………………………………………………………………………………………….61

5-4 Dot blotting…………………………………………………………………………………………………………………………………62

6-4 الکتروفورز ژل پلی اکريل آميد-SDS و وسترن بلات………………………………………………………………………………63

7-4 ارزيابی کلون های انتخابی از لحاظ داشتن ژن scFv با روش PCR……………………………………………………………65

فصل پنجم: بحث و نتيجه گيری

بحث و نتيجه گيری……………………………………………………………………………………………………………………………………66

پيشنهادات………………………………………………………………………………………………………………………………………………..73

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..74

خلاصه به زبان انگليسی………………………………………………………………………………………………………………………………83

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جداول

جدول 1-3: مواد و مقادير به کار رفته در ساخت ژل پلی اکريل آميد-SDS………………………………..50

جدول 2-3: نام و توالی پرايمرهای استفاده شده در تکنيک PCR………………………………………………55

جدول 3-3: مواد و مقادير مورد استفاده جهت انجام واکنش PCR با آنزيمTaq DNA polymerase  ……………………………………………………………… .56

جدول 1-4: تعداد کلونی های رشد يافته آلوده به رقت های مختلف فاژ آنتی بادی های رها سازی شده مربوط به دورهای اول، دوم و سوم جداسازی Library I…………………………………………………………60

جدول 2-4:  تعداد کلونی های رشد يافته آلوده به رقت های مختلف فاژ آنتی بادی های رها سازی شده مربوط به دورهای اول، دوم و سوم جداسازی Library J………………………………………………………..60

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست تصاوير

تصوير 1-2: ساختمان ايمونوگلوبولين IgG در انسان………………………………………………………………..10

تصوير 2-2: انواع مختلف آنتی بادی های نوترکيب………………………………………………………………….13

تصوير 3-2 رايج ترين روش های جداسازی……………………………………………………………………………17

تصوير 4-2: ساختمان وکتور P…………………………………………………………………………………………….21

تصوير 1-4: نتايج آزمايش الايزا با کلون های انتخاب شده ……………………………………………………….62

تصوير 2-4: آزمايش Dot blotting با کلونی های انتخاب شده نسبت به شناخت آنتی ژن توکسوپلاسما گوندئی و پروتئين BSA…………………………………………………………………………………63

تصوير 3-4: الکتروفورز آنتی ژن توکسوپلاسما گوندئی بر روی ژل پلی اکريل آميد-SDS…………..64

تصوير 4-4 آزمايش وسترن بلات…………………………………………………………………………………………64

تصوير 5-4: نتايج حاصل از بررسی کلون های انتخابی از لحاظ داشتن ژن scFv با روش……………….65