تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از ژل وارتون به اندودرم قطعی در کپسول های آلژینات

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                                                           صفحه

فصل اول

مقدمه 1

1-1-1- کپسوله کردن 2

1-1-2- تاریخچه 2

1-1-3- کپسوله کردن به عنوان ابزاری جهت مهندسی بافت و پزشکی ترمیمی 3

1-1-4- پارامترهای اصلی در کپسوله کردن سلولی 4

1-1-4-1- زیست سازگاری 4

1-1-4-2- نفوذپذیری 4

1-1-4-3-  پایداری مکانیکی 4

1-1-4-4-  شکل و اندازه کپسول 4

1-1-5- استفاده از هیدروژل ها جهت کپسوله کردن 5

1-1-6- آلژینات 5

1-1-6-1-  نحوه شکل گیری شبکه سه بعدی آلژیناتی 6

1-1-6-2- فاکتورهای تعیین کننده ویژگی های فیزیکی و زیستی آلژینات 7

1-1-6-3- مزایای کپسوله کردن آلژیناتی نسبت به سایر هیدروژل ها 8

1-1-7- مهندسی بافتی سلول های بنیادی با استفاده از داربست های هیدروژلی 9

1-2- دیابت 9

1-2-1- انواع دیابت 10

1-2-2- روش های درمانی دیابت 10

1-2-2-1- انسولین درمانی 10

1-2-2-2- سلول درمانی دیابت ملیتوس 10

1-2-2-2-1- پیوند جزایر لانگرهانس 11

1-2-2-2-2- تولید سلول های بتا از سلول های بنیادی 12

1-2-2-2-2- 1- تولید سلول های بتا از سلول های بنیادی جنینی 13

1-2-2-2-2- 2- تولید سلول های بتا از سلول های بنیادی بزرگسالان 14

1-2-2-2-2- 2-1- سلول های بنیادی مغز استخوان 15

1-2-2-2-2- 2-2- سلول های بنیادی چربی 15

1-2-2-2-2- 2-3- سلول های بنیادی روده ای 16

1-2-2-2-2- 2-4- سلول های بنیادی کبدی 16

1-2-2-2-2- 2-5- سلول های بنیادی پانکراسی 17

1-3- تکوین پانکراس17

1-3-1- تشکیل اندودرم 17

1-3-1-1- مسیر مولکولی کنترل کننده تشکیل اندودرم18

1-3-1-1-1- مسیر پیام رسانی نودال 19

1-3-1-1-2- مسیر پیام رسانی Wnt/β-catenin20

1-3-1-2- فاکتورهای رونویسی 21

1-3-1-2- 1- فاکتورهای رونویسی Mix like 21

1-3-1-2- 2- فاکتورهای رونویسی GATA4/5/621

1-3-1-2- 3- فاکتورهای رونویسی Sox1722

1-3-1-2- 4- فاکتورهای رونویسی FoxA22

1-3-2- 1- تشکیل پانکراس23

1-3-2-2- نقش برهم کنش های بافتی در شکل گیری پانکراس 25

1-3-2-3- مسیرهای مولکولی کنترل کننده تشکیل پانکراس 25

1-3-2-3-1- پیام رسانی Hedgehog26

1-3-2- 3-2- سیگنال های اندوتلیالی 26

1-3-2-3-3-  پیام رسانی FGF27

1-3-2-3-4-  پیام رسانی Notch 27

1-3-2-3-5- پیام رسانی Wnt 28

1-3-2-3-5- پیام رسانی TGF-β28

1-4- سلول بنیادی 30

1-4-1- سلول های بنیادی مزانشیمی 30

1-4-1-1- تاریخچه و خصوصیات سلول های بنیادی مزانشیمی 30

1-4-1-2- عمل متقابل بین سلول های مزانشیمی و سیستم ایمنی 31

1-4-1-3- طناب بند ناف: منبعی برای سلول های بنیادی مزانشیمی 32

1-5- فرضیه و اهداف پایان نامه 33

فصل دوم

مواد و روش ها 34

2-1- مواد، وسایل و دستگاه های مورد استفاده35

2-2- تهیه بند ناف و انتقال به آزمایشگاه 38

2-3- جداسازی ژل وارتون از بند ناف 39

2-4- استخراج سلول های مزانشیمی ژل وارتون با استفاده از روش قطعه های بافتی 39

2-5- پاساژ سلول های مزانشیمی ژل وارتون 40

2-6- انجماد و ذخیره سازی طولانی مدت سلول ها 41

2-7- شمارش سلولی42

2-8- ذوب سلول ها42

2-9- تمایز سلول های استخراج شده از ژل وارتون به سلول های چربی و استخوانی  42

2-9-1- تهیه محیط تمایزی جهت تمایز سلول های مزانشیمی ژل وارتون به سلول های چربی 42

2-9-2- تمایز سلول های مزانشیمی به سلول های چربی 43

2-9-3- روش رنگ آمیزی Oil Red O44

2-9-4- تهیه محیط تمایزی جهت تمایز سلول های مزانشیمی ژل وارتون به سلول های استخوانی 44

2-9-5- تمایز سلول های مزانشیمی به سلول های استخوانی 45

2-9-6- روش رنگ آمیزی Alizarin Red S45

2-10- بررسی مارکرهای سطحی سلول های استخراج شده از ژل وارتون بند ناف 46

2-11- کشت سه بعدی سلول ها 47

2-11-1- تهیه محلول آلژینات 47

2-11-2- تهیه محلول پلیمریزه کننده 47

2-11-2- تهیه محلول دپلیمریزه کننده47

2-11-4- کپسوله کردن و کشت سه بعدی سلول ها 48

2-12- بررسی مورفولوژی کپسول ها و اندازه گیری قطر آنها50

2-13- بررسی تغییرات ظاهری کپسول ها و سلول های بنیادی مزانشیمی محصور در آنها 50

2-14- نحوه بررسی اثرات سدیم آلژینات، کلسیم کلرید و سدیم سیترات بر روی بقای سلول های بنیادی 50

2-15- روش تریپان بلو برای بررسی درصد بقای سلول ها50

2-16- تمایز سلول ها در کشت سه بعدی 51

2-17- تکنیک PCR با زمان واقعی (Real-time PCR) 52

2-17-1- مفاهیم متداول در Real-time PCR 53

2-17-2- استفاده از سایبرگرین І به عنوان یک روش شناسایی در Real-time PCR 54

2-17-3- استخراج RNA55

2-17-4- تعیین میزان غلظت RNA استخراج شده57

2-17-5- طراحی پرایمرهای اختصاصی 57

2-17-6- نسخه برداری معکوس و سنتز cDNA 58

2-17-7- بررسی بیان ژن ها به روش Real-time PCR59

2-17-8- آنالیزها در Real- time PCR59

2-17-8- 1- روش مقایسه نسبی59

2-18- آنالیز آماری 60

فصل سوم

نتایج61

3-1- نتایج حاصل از استخراج و کشت سلول های بنیادی مزانشیمی ژل وارتون با استفاده از روش قطعه های بافتی  62

3-2- نتایج حاصل از تمایز سلول های استخراج شده از ژل وارتون به سلول های چربی و استخوانی  64

3-3- نتایج به دست آمده از بررسی بیان مارکرهای سطحی سلول های مزانشیمی توسط روش فلوسیتومتری  65

3-5- نتایج حاصل از بررسی مورفولوژی کپسول ها و اندازه گیری قطر آنها توسط میکروسکوپ   67

3-5- نتایج حاصل از بررسی تغییرات ظاهری کپسول ها   68

3-6- نتایج حاصل از بررسی مورفولوژی سلول های بنیادی مزانشیمی ژل وارتون در کپسول های آلژیناتی 68

3-7- نتایج به دست آمده از بررسی بقای سلول های بنیادی کپسوله شده توسط رنگ آمیزی تریپان بلو70

3-8- نتایج حاصل از بررسی بیان ژن های FOXa2 و SOX17 در سلول های دکپسوله شده پس از القای تمایز به سمت اندودرم قطعی با روش Real- time PCR 71

فصل چهارم

بحث و نتیجه گیری کلی  74

4-1- بحث و تفسیر 75

4-2- نتیجه گیری کلی86

4-3- پیشنهادات   86

فصل پنجم

منابع   88