تقویت سیگنال لومینسانس جهت ردیابی ویروس هپاتیت B مبتنی بر نانوذرات طلای اصلاح شده

تعداد 23صفحه در فایلword

چکیده:

 ایمنوحسگرها یکی از ابزارهای ویژه برای تشخیص آنتی ژنها هستند که اهمیت آن در عملکرد اختصاصی آن ها نسبت به آنتی ژنها است. از ایمنوحسگرها به طور گسترده در زمینه های پزشکی، داروئی و امنیت غذایی استفاده می شود. در طول دهه گذشته به شیمی لومینسانس بر پایه سنجش ایمنی توجه زیادی شده است زیرا دارای ویژگی هایی مانند حساسیت بالا، گستره تشخیصی وسیع، سیگنال زمینه پایین و فناوری ساخت آسان می باشند. روش های ایمنوحسگری از نوع لومینسانس مبتنی بر آنتی بادی، مشتقات لومینول و نانوذرات طلا به همراه کاتالیزورهای مختلف، جهت تشخیص آنتی ژن استفاده می شود. طرح های گوناگونی وجود دارد که هر کدام توانستند بخش هایی از تقویت سیگنال نوری را به واسطه نانوذرات طلا افزایش دهند. لذا برای تشخیص و ردیابی هپاتیت B از این روش ها استفاده شد. به دلیل استفاده از دو دسته آنتی بادی شامل پلی کلونال و منوکلونال، قدرت تشخیص انتخابی این روش نسبت به سایر روش های مشابه افزایش یافته است. در این پژوهش، نشانگری از نانوذرات طلا به قطر حدود 18 نانومتر طراحی و ساخته شد که حامل تعداد زیادی مولکول لومینول و تعداد اندکی بیوتین است. در این طراحی، از بیوتینی استفاده شده است که نسبت به مولکول های دیگر طول بیشتری را دارد. این مزیت باعث شده که بیوتین متصل به نانوذره طلا، راحت تر در دسترس استرپتواویدین قرار گیرد که این خود گامی در تقویت سیگنال شیمی لومینسانس می باشد. در نهایت این نانوذره، به عنوان نشانگر از طریق بیوتین به آنتی بادی ثانویه اصلاح شده با استرپتواویدین متصل می شود. از طرفی، استرپتواویدین دارای 4 جایگاه اتصال برای بیوتین است و این موجب می شود که به ازای هر استرپتواویدین کانژوگه به آنتی بادی، حداکثر 4 نانوذره به واسطه بیوتین به آن متصل شود. این گامی دیگر در افزایش تقویت سیگنال شیمی لومینسانس است. فرآیند کار بدین ترتیب است که ابتدا پلیت های 96 تایی پلی استیرن با آنتی بادی اولیه پوشیده شده، و سپس به آن ها، آنتی ژن اضافه گردید. پس از انکوباسیون شستشوی چاهک ها انجام گرفت و به منظور تکمیل ساندویچ ایمنی، آنتی بادی ثانویه اصلاح شده با استرپتواویدین به چاهک ها افزوده شد. پس از شستشوی مجدد نانوذرات طلای حامل لومینول و بیوتین، به ساندویچ ایمنی اضافه گردید. پس از شستشوی نهایی، در حضور کاتالیزور و پراکسید هیدروژن، نشر شیمی لومینسانس حاصل از کمپلکس (آنتی بادی اولیه-آنتی ژن- آنتی بادی ثانویه-استرپتواویدین- بیوتین- نانوذرات طلا-لومینول) قرائت شد. پس از بهینه کردن شرایط آزمون، منحنی استاندارد برای تعیین غلظت های مختلف آنتی ژن، رسم شد. که گستره خطی و حد تشخیص به ترتیب 1920 -7/1 و 358/0 پیکوگرم در میلی لیتر به دست آمد. در نهایت عملکرد اختصاصی این روش نسبت به آنتی ژن مورد نظر در مقایسه با دیگر گونه های آنتی ژنی موجود در نمونه های آزمایشگاهی و نمونه های حقیقی مورد ارزیابی قرار گرفت که نتیجه گویای عملکرد اختصاصی این روش بود. از دیگر نتایج این پژوهش، ارتقاء حساسیت نسبت به الایزا با استفاده از نشانگر طلای عامل دار شده با بیوتین و لومینول می باشد.