تغییرات آپوپتوزی و اثرات سمی در تیمار همزمان تاموکسیفن و کورکومین قرار گرفته در نانو حامل پلیمر

فهرست مطالب

1-فصل اول: مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته

1-1-سرطان سینه……………………………………………………………………………………………………………………………………….1

1-1-1-ریسک فاکتوره  ………………………………………………………………………………………………………………………………1

1-1-2-طبقه بندی سرطان سینه بر اساس بافت شناسی …………………………………………………………………………2

1-1-3-طبقه بندی سلول های سرطانی سینه بر اساس گیرنده های سطحی …………………………………………2

1-2- انواع دارو درمانی ………………………………………………………………………………………………………………………………3

1-2-1-تاموکسیفن………………………………………………………………………………………………………………………………………4

1-2-1-1مکانیسم عمل تاموکسیفن …………………………………………………………………………………………………………..6

1-2-1-2-اثرات جانبی………………………………………………………………………………………………………………………………..7

1-2-1-3-اثر تاموکسیفن بر روی سلول هایی غیر از سرطان سینه………………………………………………………….7

1-2-1-4-اثر تاموکسیفن بر روی رده ی سلولی سرطان سینه………………………………………………………………….8

1-2-1-5-مقاومت به تاموکسیفن……………………………………………………………………………………………………………….9

1-2-2-کورکومین……………………………………………………………………………………………………………………………………….9

1-2-2-1-اثرات جانبی کورکومین ………………………………………………………………………………………………………….12

1-2-2-2-اثرات ضد سرطانی کورکومین ………………………………………………………………………………………………..12

1-2-2-3-اثر کورکومین بر روی رده ی سلولی سرطان سینه  ……………………………………………………………..14

1-3-مکانیسم آپوپتوزی وابسته به BAX ,P53 وbsl2  ……………………………………………………………………..15

1-4-مقاومت دارویی سلول های سرطان سینه به تاموکسیفن  ……………………………………………………………..16

1-4-1-کسب ویژگی های سلول های بنیادی توسط سلول های مقاوم به تاموکسیفن………………………….17

1-4-2-تغییرات اپی ژنتیکی در سلول های مقاوم به دارو  …………………………………………………………………….18

1-5-مکانیسم های اثر کورکومین در مقابله با مقاومت دارویی  ……………………………………………………………..19

1-6- راه های افزایش دسترسی زیستی به کورکومین  …………………………………………………………………………..20

1-6-1- کورکومین بار گذاری شده در لیپوزوم،میسل و فسفولیپید  ……………………………………………………..21

1-7-نانوذرات ……………………………………………………………………………………………………………………………………………21

1-7-1-دندروزوم ها  ………………………………………………………………………………………………………………………………..22

1-8-نمای کلی تحقیق …………………………………………………………………………………………………………………………….23

1-9-پیش فرض ها  …………………………………………………………………………………………………………………………………24

2-فصل دوم: مواد و روش ها

2-1- بارگذاری دارو ها در نانو حامل پلیمری  ………………………………………………………………………………………..25

2-2-کشت یاخته ها  ……………………………………………………………………………………………………………………………….26

2-2-1- تهیه ی محلول محیط کشتDMEM    ………………………………………………………………………………..26

2-2-2-نگهداری از یاخته ها  ………………………………………………………………………………………………………………….27

2-2-3-پاساژ یاخته ها  ……………………………………………………………………………………………………………………………28

2-2-4-تهیه ی محلول بافر نمکی فسفات  ……………………………………………………………………………………………29

2-2-5- انجماد یاخته ها  ………………………………………………………………………………………………………………………..29

2-2-6-ذوب یاخته ها  …………………………………………………………………………………………………………………………….31

2-2-7- شمارش یاخته ها    …………………………………………………………………………………………………………………..31

2-3- آزمون سنجش MTT  …………………………………………………………………………………………………………………32

2-3-1-تهیه ی محلول MTT      …………………………………………………………………………………………………………33

2-3-2- انجام آزمون    MTT………………………………………………………………………………………………………………..33

2-4-فلوسایتومتری    ………………………………………………………………………………………………………………………………35

2-4-1-روش تهیه ی  محلول Annexin-V-FLOUS  .    …………………………………………………………….36

2-4-2-آنالیز سلول های رنگ آمیزی شده با کمک دستگاه فلوسایتومتری…………………………………………..37

2-4-3-آنالیز چرخه ی سلولی با استفاده از تکنیک فلوسایتومتری و رنگ آمیزی PI……………………….38

2-5- بررسی تغییرات بیان ژن با استفاده از تکنیک  Real Time PCR…………………………………………..40

2-5-1- استخراج RNA…………………………………………………………………………………………………………………………40

2-5-2-بررسی کمی و کیفی RNA ی استخراج شده…………………………………………………………………………..42

2-5-3-الکتروفورز ژل آگارز………………………………………………………………………………………………………………………42

2-5-4-تیمار با  DNAse1…………………………………………………………………………………………………………………….44

2-5-5-سنتز CDNA از RNA های استخراج شده …………………………………………………………………………..45

2-5-6-طراحی پرایمر……………………………………………………………………………………………………………………………….46

2-5-7-آماده سازی پرایمرها…………………………………………………………………………………………………………………….47

2-5-8-واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)……………………………………………………………………………………………..48

2-5-9-بررسی کمی بیان ژن با فناوری Real Time RT-PCR ……………………………………………………..49

2-5-10-واکنش Real-timePCR …………………………………………………………………………………………………….49

2-6: مقاوم سازی داروها به تاموکسیفن……………………………………………………………………………………………………52

3-فصل سوم: نتایج یافته ها

3-1- سلول های سرطانی MCF7………………………………………………………………………………………………………….53

3-1-1 بررسی بقای سلول های MCF7 توسط تستMTT ……………………………………………………………….53

3-1-2- آنالیز چرخه ی سلولی با استفاده از دستگاه فلوسایتومتری و رنگ آمیزی PI………………………….63

3-1-3- آنالیز مرگ سلول های MCF7 تیمار شده با نانو(کورکومین+تاموکسیفن)،

نانوتاموکسیفن و تاموکسیفن………………………………………………………………………………………………………………………66

3-1-4-بررسی بیان ژن هایBAX و bcl2 ………………………………………………………………………………………….70

3-2-سلول های مقاوم به تاموکسیفن……………………………………………………………………………………………………….74

3-2-1-بررسی بقای سلول هایMCF7 مقاوم به تاموکسیفن……………………………………………………………….74

3-2-2- آنالیز چرخه ی سلولی سلول هایMCF7 مقاوم به دارو با استفاده از دستگاه فلوسایتومتری و رنگ آمیزی PI …………………………………………………………………………………………………………………………………………80

3-2-3- آنالیز مرگ و فاز سلول های MCF7 مقاوم به تاموکسیفن توسط تست Annexin و………….83

فصل4: نتیجه گیری و پیشنهادات

4-1-ضرورت تحقیق و اهداف آن……………………………………………………………………………………………………………..88

4-2- فرضیه ها و پیش فرض ها……………………………………………………………………………………………………………….89

4-3- سلول های سرطانی MCF7 …………………………………………………………………………………………………………90

4-3-1- اثر سمییت نانو (تاموکسیفن+کورکومین)، نانوتاموکسیفن و تاموکسیفن بر سلول های

 سرطانی سینه و نرمال ……………………………………………………………………………………………………………………………..90

4-3-2- آنالیز مرگ و فاز سلول های MCF7 توسط تست Annexin و PI ……………………………………92

4-3-3- بررسی بیان ژن هایBAX  و bcl2…………………………………………………………………………………………93

4-4- سلول های MCF7 مقاوم به دارو ی تاموکسیفن…………………………………………………………………………93

4-4-1-اثر سمیت نانو (تاموکسیفن+کورکومین)، نانو تاموکسیفن و تاموکسیفن بر سلول های

MCF7 مقاوم به دارو……………………………………………………………………………………………………………………………….94

4-4-2- آنالیز مرگ و فاز سلول های MCF7 توسط تست Annexin و PI ……………………………………..96

4-5-نتیجه گیری و پیشنهاد…………………………………………………………………………………………………………………….98

4-6-پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………………98

فهرست منابع و مراجع…………………………………………………………………………………………………………………………….100

فهرست شکل ها و جدول ها

شکل1-1 : فرمول ساختاری و مدل گوی و میله ی داروی تاموکسیفن…………………………………………………….5

شکل 1-2: فرمول ساختاری و مدل گوی و میله ی کورکومین……………………………………………………………….10

شکل 1-3: موارد رایج استفاده از کورکومین که با اهداف درمان همراه است………………………………………….11

شکل 1-4: خواص بالقوه ی کورکومین که توسط تکنولوژی مدرن، آشکار شده است…………………………….12

شکل 1-5: کورکومین در درمان بسیاری از سرطان ها مورد استفاده قرار می گیرد………………………………12

شکل 1-6: مراحلی از سرطان که کورکومین میتواند از پیشرفت آن جلوگیری کند………………………………13

شکل 1-7: نگاهی بر خاصیت ضد سرطان کورکومین…………………………………………………………………………….14

شکل1-8: مکانیسم آپوپتوزی وابسته به P53………………………………………………………………………………………..16

شکل 1-9: نانو ذرات به انتقال دارو کمک میکنند………………………………………………………………………………….20

شکل 1-10: سیستم انتقال دارو به کمک نانو ذرات یک سیستم هدایت کننده ی برنامه ریزی شده است…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….22

نمودرا 3-1: منحنی استاندارد مربوط به  MTT در سلولهای MCF7 به همراه خط رگرسیون…………53

نمودار 3-2: نمودار مربوط به تست 24 ساعته ی MTT سلول های MCF7 و سلول های نرمال فیبروبلاست تیمار شده  با داروی نانو(تاموکسیفن+کورکومین) ……………………………………………………………..55

نمودار 3-3: نمودار مربوط به تست48 ساعته ی MTT سلول های MCF7 و سلول های نرمال فیبروبلاست تیمار شده با داروی نانو (تاموکسیفن+کورکومین……………………………………………………………….55

نمودار3-5: نمودار مربوط به تست 24 ساعته ی MTT سلول های نرمال فیبروبلاست و سلول های MCF7 تیمار شده با داروی نانوتاموکسیفن ………………………………………………………………………………………….56

نمودار3-6: نمودار مربوط به تست 48 ساعته ی MTT سلول های نرمال فیبروبلاست و سلول های MCF7 تیمار شده با داروی نانوتاموکسیفن …………………………………………………………………………………………56

نمودار3-7: نمودار مربوط به تست 72 ساعته ی MTT سلول های نرمال فیبروبلاست و سلول های MCF7 تیمار شده با داروی نانوتاموکسیفن……………………………………………………………………………………………57

نمودار3-8: نمودار مربوط به تست 24 ساعته ی MTT سلول های MCF7 و سلول های  نرمال تیمار شده با داروی تاموکسیفن می باشد…………………………………………………………………………………………………………..58

نمودار3-9: نمودار مربوط به تست 48 ساعته ی MTT سلول های MCF7 و سلول های  نرمال  فیبروبلاست تیمار شده با داروی تاموکسیفن…………………………………………………………………………………………..59

نمودار3-10: نمودار مربوط به تست72 ساعته ی MTT سلول های MCF7 و سلول های  نرمال تیمار شده  با داروی تاموکسیفن……………………………………………………………………………………………………………………….59

نمودار3-11: نمودار  مربوط به تست 24 ساعته ی MTT سلول های MCF7 و سلول های  نرمال تیمار شده با داروی  نانو کورکومین…………………………………………………………………………………………………………60

نمودار3-12: نمودار مربوط به تست 48 ساعته ی MTT سلول های MCF7 و سلول های  نرمال تیمار شده با داروی  نانوکورکومین……………………………………………………………………………………………………………………61

نمودار3-13: نمودار مربوط به تست 72 ساعته ی MTT سلول های MCF7 و سلول های  نرمال تیمار شده با  داروی  نانو کورکومین…………………………………………………………………………………………………………………61

نمودار3-14: نمودار مربوط به تست 24 ساعته ی MTT سلول های MCF7 و سلول های  نرمال تیمار شده با  نانو حامل  پلیمری   OM200………………………………………………………………………………………………..62

نمودار3-15: نمودار مربوط به تست 48 ساعته ی MTT سلول های MCF7 و سلول های  نرمال تیمار شده با  نانو حامل  پلیمری  OM200………………………………………………………………………………………………….63

شکل 3-1: نمودار های چرخه ی سلولی حاصل از PI  تست……………………………………………………………….65

نمودار3-16: نمودار چرخه ی سلولی سلول های تیمار شده با داروهای تاموکسیفن……………………………66

شکل 3-2: آنالیز مرگ سلولی در سلول های MCF7 تیمار شده با سه داروی………………………………….69

نمودار 3-17: آنالیز مرگ در سلول های  MCF7 تیمار شده با دارو…………………………………………………..70

شکل 3-3: برسی کیفیت RNA استخراج شده  بر روی ژل آگارز……………………………………………………..71

شکل3-4:  بررسی کیفیت پرایمرها و CDNA سنتز شده با استفاده از ژل آگارز…………………………….71

شکل 3-5: منحنی های ذوب ژن های BAX, bcl2 و gapdh به همراه amplification plot..72

نمودار3-18: نمودار بیان BAX در سلول های MCF7 تیمار شده با دارو……………………………………..73

نمودار 3-19: نمودار بیان bcl2 در سلول های mcf7 تیمار شده با دارو…………………………………………73

نمودار 3-20: نمودار مربوط به تست 24 ساعته ی MTT سلول های MCF7 مقاوم به تاموکسیفن برای داروی نانو( تاموکسیفن +کورکومین)…………………………………………………………………………………………….74

نمودار3-21: نمودار مربوط به تست 48 ساعته ی MTT سلول های MCF7 مقاوم به تاموکسیفن برای داروی نانو( تاموکسیفن +کورکومین)……………………………………………………………………………………………………..75

نمودار3-22: نمودار مربوط به تست 72 ساعته ی MTT سلول های MCF7 مقاوم به تاموکسیفن برای داروی نانو( تاموکسیفن +کورکومین)……………………………………………………………………………………………………..75

نمودار3-24: نمودار مربوط به تست 48 ساعته ی MTT سلول های MCF7 مقاوم به تاموکسیفن داروی نانو تاموکسیفن می باشد………………………………………………………………………………………………………………77

نمودار 3-25: نمودار مربوط به تست72  ساعته ی MTT سلول های MCF7 مقاوم به تاموکسیفن داروی نانو تاموکسیفن………………………………………………………………………………………………………………………………77

نمودار 3-26: نمودار مربوط به تست 24 ساعته ی MTT سلول های MCF7 مقاوم به دارو داروی تاموکسیفن……………………………………………………………………………………………………………………………………………….78

نمودار3-27: نمودار بالا مربوط به تست 48 ساعته ی MTT سلول های MCF7 مقاوم به تاموکسیفن داروی  تاموکسیفن…………………………………………………………………………………………………………………………………..79

نمودار 3-28: نمودار مربوط به تست 72 ساعته ی MTT سلول های MCF7 مقاوم به دارو داروی تاموکسیفن……………………………………………………………………………………………………………………………………………..79

شکل 3-6: هیستوگرام سنجش چرخه ی سلولی در تیمار های دارویی سلول های مقاوم به تاموکسیفن MCF7………………………………………………………………………………………………………………………………………………….82

نمودار 3-29: نمودار چرخه ی سلولی تیمار های دارویی سلول های MCF7 مقاوم به تاموکسیفن.83

شکل 3-7: آنالیز مرگ سلولی در سلول های MCF7 مقاوم به تاموکسیفن………………………………………86

نمودار 3-30: نمودار آپوپتوز سلول های MCF7 مقاوم به تاموکسیفن………………………………………………..86

نمودار 3-31: نمودار بررسی  نکروز در تیمار های دارویی سلول های  MCF7 مقاوم به تاموکسیفن.87

جدول2-1: تهیه ی Master Mix برای یک واکنش سنتز CDNA………………………………………………..46

جدول 2-2: جدول برایمر های طراحی شده……………………………………………………………………………………………47

جدول2-3: برنامه ی RT-PCR…………………………………………………………………………………………………………….49

جدول2-4: مقادیر لازم به ازای هر واکنش Real-time PCR…………………………………………………………..51

جدول 2-5: برنامه یReal-time PCR……………………………………………………………………………………………..52

جدول 4-1:IC50 بدست آمده برای رده ی سلولی MCF7 و نرمال فیبروبلاست…………………………….90