%31تخفیف

تعيين اپي‏توپ‏هاي توكسين بتا كلستريديوم پرفرنژنس با استفاده از تکنيک‏هاي مولكولي  

تعداد 122صفحه در فایل word

کارشناسي ارشد رشته­ی زیست ­فناوری ميکروبي

 

 

 

تعيين اپي‏توپ‏هاي توكسين بتا كلستريديوم پرفرنژنس با استفاده از تکنيک‏هاي مولكولي

 

 

چکيده

 

   در بعضي موارد پاسخ­هاي القا شده­ توسط ايمونوژن طبیعی بهينه نمي­باشد و­ قرار گرفتن چند اپي­توپ کنار هم­­ پاسخ ايمني را به طور قابل توجهي افزايش مي­دهند. هدف از اين پروژه نيز تهيه قطعه مشخصي از توکسين بتا داراي تمرکز اپي­توپي با توان آنتي­ژني مناسب مي­باشد. کلستريديوم پرفرنژنس تیپ  Bو ­C ترشح­کننده توکسين بتا بوده که باعث ايجاد آنتريت نکروتيک در انسان و دام ­مي­شود. مرگ و مير در افراد مبتلا به اين بيماري به بيش از 50 درصد مي­رسد. بنابراين پيشگيري و تشخيص هر دو لازمه مقابله با ­اين بيماري است. براي دستيابي به اجزاي موثرتر جهت ايمني­زايي ابتدا با کمک ابزارهاي بيوانفورماتيک بر اساس ساختار دوم، پرايمرهاي مختلف از ژن توکسين بتا طراحي و قطعات مختلف بوسيله PCR تهيه گرديد. ناحيه­اي از توکسين بتا که داراي بيشترين آنتي­ژنيسيته بوده و با بقيه قطعات      هم­پوشاني دارد جهت کلونينگ انتخاب گرديد. این قطعه در PTZ57RT کلون و سپس در pET21a(+) ساب کلون گردید.­­ اين ناقل در ­E. coli BL21(DE3) ترانسفورم شد. بيان پروتئين نوتركيب با استفاده از­ 100­ ميلي مولار IPTG­ القا و پروتئين نوترکيب توسط دات ­بلات، وسترن ­بلات و الايزا با آنتي­سرم خرگوشي توکسين طبیعی مورد ارزيابي قرار گرفت. مقايسه کمي حساسيت آنتي­ژن نوترکيب با آنتي­ژن طبیعی بتا از طريق واکنش متقاطع الايزا با آنتي­بادي­هاي همولوگي و غيرهمولوگي بررسي گردید. بررسي نتايج بيان پروتئين نوترکيب با تکنيک­هاي ايمونوشيميايي نشان داد که پروتئين نوترکيب به صورت اختصاصي با آنتي­بادي ضد توکسين طبیعی وارد واکنش شده و داراي       آنتي­ژنيسيته مناسب مي­باشد. نتايج واکنش متقاطع نيز نشان داد که آنتي­ژن طبیعی بتا با آنتي­بادي غيرهمولوگي واکنش بسيار قوي دارند. بنابراين آنتي­بادي اختصاصی ضد آنتی­ژن نوترکيب مي­تواند جايگزين بسيار مناسب آنتي­بادي ضد توکسين طبیعی باشد و در طراحي کيت­هاي تشخيصي جهت تشخيص کلينيکي بيماري آنتريت نکروتيک کاربرد داشته باشد. از طرف ديگر از طريق شناسايي مناطق اپي­توپي توکسين­هاي ديگر کلستريديوم پرفرنژنس و اتصال آن­ها به هم، مي­توان واکسن­هايي را­ بر عليه ترکيبي از اپي­توپ­ها طراحي کرد و با حداقل هزينه سرعت ايمني زايي را بالا برد.

واژگان کليدي: کلستريديوم پرفرنژنس، آنتي­ژن طبیعی بتا­، آنتي­ژن نوترکيب، اپي­توپ.

 

 



فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                       صفحه

فصل اول: مروری بر منابع

1-1- خانواده کلستريديا.. 1

1-2- معرفي جنس کلستريديوم پرفرنژنس.. 3

1-2-1- کلستريديوم پرفرنژنس تيپ A.. 4

1-2-2- کلستريديوم پرفرنژنس تيپ B.. 5

1-2-3- کلستريديوم پرفرنژنس تيپ C.. 5

1-2-4- کلستريديوم پرفرنژنس تيپ D.. 6

1-2-5- کلستريديوم پرفرنژنس تيپ E.. 6

1-3- توکسين­هاي کلستريديوم پرفرنژنس.. 6

1-3-1- توکسين آلفا.. 6

1-3-2- توکسين بتا.. 7

1-3-3- توکسين اپسيلون.. 7

1-3-4- توکسين يوتا.. 8

1-4- توکسين­های تشکيل­ دهنده­ی منفذ.. 10

1-5- خصوصيات کلي توکسين بتا.. 11

1-5-1- بررسي ژن و توالي نوکلئوتيدي توکسين بتا.. 11

1-5-2- آناليز و بررسي اسيدآمينه­اي توکسين بتا.. 11

1-5-3- خصوصيات پروتئين توکسين بتا.. 12

1-5-4- اثر توکسين بتا بر بافت و اندام­ها.. 13

1-5-5- اثر توکسين بتا بر کشت سلول.. 14

1-5-6- مکانيسم مولکولي توکسين بتا.. 15

1-5-7- همولوژي توکسين بتا با ساير پروتئين­ها.. 16

1-6- اهميت مطالعه روش­هاي تشخيصي و درماني کلستريديوم پرفرنژنس   16

1-7- آنتي­ژنسيته.. 16

1-7-1- ايمني­زايي.. 17

1-7-2- اپي­توپ (شاخص آنتي­ژني).. 17

1-7-3- اپي­توپ­هاي غالب.. 19

عنوان                                                                                                                       صفحه

1-7-4- پيش بيني اپي­توپ­ها.. 20

1-7-5- آنتي­بادي­ها.. 20

1-8- فناوري DNA نوترکيب.. 22

1-8-1-کلونينگ.. 22

1-8-2- عوامل موثر بر ميزان بيان پروتئين نوترکيب.. 24

1-8-3- انواع وکتورهاي پلاسميدي در E. coli 24

1-8-3-1- وکتورهاي پلاسميدي کلونينگ.. 24

1-8-3-2- وکتورهاي پلاسميدي بياني.. 25

1-8-4- آنتی­ژن­های کوچک را می­توان به طور مصنوعی یا کلونینگ تهیه کرد   26

1-8-5- کاربرد آنتی­ژن­های نوترکیب.. 26

1-9- واکسن­های سنتی کلستریدیوم پرفرنژنس.. 27

1-9-1- نقش آنتی­ژن­های نوترکیب در تولید واکسن­ها.. 28

1-9-2- قطعات زیرواحد آنتی­ژنی در تهیه واکسن.. 29

1-10- پروتئین فیوژن.. 29

1-11- مروری بر تحقیقات گذشته.. 30

1-12- اهداف تحقيق.. 33

فصل دوم: مواد و روش­ها

2-1- تهيه باکتري کلستريديوم پرفرنژنس تيپ B.. 35

2-2- سنجش فعالیت توکسین بتا.. 35

2-2-1- تست همولیز کیفی.. 35

2-2-2- تست همولیز کمی.. 35

2-3- خالص­سازی توکسین بتا (BT) کلستریدیوم پرفرنژنس تیپ B.. 36

2-3-1- رسوب­دهی با آمونیوم­سولفات.. 36

2-3-2-كروماتوگرافي تعويض كاتيونی.. 36

2-3-3- پروتئین سنجی به روش برادفورد.. 37

2-4-SDS-PAGE  پروتئین‌ها.. 38

2-4-1- تهیه ژل الکتروفورز SDS-PAGE.. 39

2-4-2- رنگ­آمیزی با نیترات نقره.. 40

عنوان                                                                                                                       صفحه

2-5- تهیه آنتی­بادی پلی­کلونال.. 42

2-5-1- مراحل تهیه نانوپارتیکل کیتوزان.. 42

2-5-2- مراحل تزریق توکسین بتا به خرگوش.. 43

2-6- شناسایی پروتئین­ها.. 43

2-6-1- شناسایی پروتئين‌ها توسط دات بلات.. 43

2-6-2- شناسایی پروتئين‌ها توسط وسترن بلات.. 45

2-7- تایید مولکولی کلستریدیوم پرفرنژنس تیپ B.. 49

2-8- استخراج DNA کروموزومی.. 49

2-8-1- روش فنل-­کلروفرم.. 49

2-8-2- روش جوشاندن.. 50

2-9- مطالعات بیوانفورماتیک و طراحی پرایمرهای اختصاصی.. 51

2-10- تهیه پرایمر.. 51

2-12- کنترل کمیت و کیفیت DNA مورد آزمون.. 51

2-12-1- الکتروفورز روی ژل آگارز.. 51

2-12-2- تعیین کمیت DNA.. 52

2-13- محیط­های کشت باکتری.. 53

2-13-1- محیط کشت LB مایع.. 53

2-13-2- محیط کشت LB جامد.. 53

2-13-3- محیط کشت LB آگار  حاوی آمپی­سیلین.. 54

2-14- تکثیر DNA توسط  PCR.. 54

2-15- کلون کردن محصولPCR  به روش T/A کلونینگ.. 55

2-15-1- اجزای کیت T/A کلونینگ محصول PCR.. 56

2-16- تهیه سلول‌های مستعد باکتری.. 57

2-17- مراحل انجام کلونینگ.. 58

2-17-1- واکنش الحاق قطعه 5 به ناقل pTZ57R/T.. 58

2-17-2- انتقال ناقل به سلول‌های مستعد.. 60

2-17-3- غربالگری سلول‌های نوترکیب‌ 60

2-18- تایید همسانه­سازی ژن درون ناقل pTZ57R/T.. 61

عنوان                                                                                                                       صفحه

2-18-1- تایید کلنی­های حاصل با روش PCR.. 61

2-18-2- ردیابی سریع پلاسمید.. 62

2-19- استخراج پلاسميد در مقياس زياد.. 62

2-20- تعیین کیفیت و کمیت پلاسمید نوترکیب استخراج شده.. 63

2-21- القای بیان ژن.. 63

2-21-1- وکتور بیانی PET21. 63

2-21-2- هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب PTZ57R/T حاوی قطعه مورد نظر   65

2-21-3- هضم آنزیمی وکتور بیانی PET21. 65

2-21-4- استخراج DNA از روی ژل آگارز.. 65

2-21-5- واکنش الحاق قطعه­ی5 به ناقلPET21. 66

2-21-5-1- انتخاب نسبت vector/insert 66

2-21-5-2- آماده سازی اجزای واکنش الحاق سیستم بیانی.. 66

2-22-5- القای سیستم بیانی.. 67

2-23- استخراج پروتئین‌های نوترکیب.. 68

2-24- تولید آنتی­بادی پلی­کلونال موشی علیه پروتئین نوترکیب rBTF5  68

2-25- واکنش متقاطع جهت مقایسه کمی آنتی­ژنسیته آنتی­ژن BT و آنتی­ژن نوترکیب rBTF5. 69

فصل سوم: نتایج

3-1- بررسی رشد باکتری کلستریدیوم پرفرنژنس تیپ B.. 71

3-2-1- تست همولیز کیفی.. 73

3-2-2- تست همولیز کمی.. 73

3-3- خالص­سازی توکسین بتا (BT) کلستریدیوم پرفرنژنس تیپB.. 74

3-4- نمودار تعیین وزن مولکولی توکسین بتا.. 75

3-5- توليد آنتي‌بادي اختصاصی ضد توکسین بتا.. 76

3-5-1- بررسی اولیه تولید آنتی­بادی اختصاصی ضد توکسین بتا توسط دات بلات   76

3-5-2- بررسی تولید آنتی­بادی اختصاصی ضد توکسین بتا توسط وسترن بلات   77

3-6- استخراج  DNAژنومی از باکتری کلستریدیوم پرفرنژنس تیپ B   78

3-7- مطالعات بیوانفورماتیک و طراحی پرایمرها.. 79

3-8- تکثیر قطعات مختلف با PCR.. 85

عنوان                                                                                                                       صفحه

3-9- خالص­سازی قطعه­ی 5.. 86

3-10- T/A کلونینگ.. 87

3-11- الحاق قطعه­ی 5 به ناقل pTZ57R/T.. 88

3-12- هضم آنزیمی دوگانه پلاسمید نوترکیب PTZ57R/T حاوی قطعه 5   89

3-13- نتایج حاصل از کلونینگ در سیستم بیانی.. 92

3-15- شناسایی اولیه پروتئین نوترکیب قطعه­ی 5 (rBTF5) توسط دات بلات   93

3-16- بررسی اولیه پروتئین نوترکیب rBTF5. 94

3-17- وسترن بلات پروتئین نوترکیب rBTF5. 95

3-18- آزمایش اتصال آنتی­ژن نوترکیب rBTF5 با آنتی­بادی اختصاصی   95

3-19- توليد آنتي‌بادي اختصاصی rBTF5. 97

3-19-1- بررسی اولیه تولید آنتی­بادی اختصاصی rBTF5 توسط دات بلات   97

3-19-2- بررسی تولید پروتئین نوترکیب rBTF5 توسط وسترن بلات.. 98

3-20- واکنش متقاطع جهت مقایسه آنتی­ژنسیته دو آنتی­ژن BT و آنتی­ژن نوترکیب rBTF5. 98

3-21- مقایسه کمی آنتی­ژنسیته آنتی­ژن BT با آنتی­ژن نوترکیب rBTF5 توسط روش الیزا.. 100

فصل چهارم: بحث

پیشنهادات.. 109

پیوست.. 116

فهرست منابع .. 110

فهرست شکل­ها­

عنوان                                                                                                                                    صفحه

شکل1-1- Perfringolysin O (PFO)، ساختار ايجاد کننده­ی منفذ.. 10

شکل1-2- هيستوپاتولوژي و ايمونوهيستوشيمي قرارگيري CPB… 13

شکل1-3- مشاهدات ميکروسکوپي سلولهاي کنترلي I407 تحت تاثير توکسين بتا   14

شکل1-4- تغييرات مورفولوژيکي در سلولهاي 60HL به دنبال در معرض قرار گرفتن توکسين… 15

شکل1-5- موقعیت اپي­توپ­هاي خطي توکسين بتا کلستريديوم پرفرنژنس تيپB 18

شکل1-6- اپي­توپ­هاي خطي و ناپيوسته.. 19

شکل1-7- ساختار شماتیک آنتی­بادی.. 21

شکل1-8- نمايش شماتيک از ايمني همورال.. 22

شکل 1-9- گراس پاتولوژي و مشاهدات هيستوپاتولوژي موش­ها با توکسين کلستريديوم پرفرنژنس… 33

شکل2-1- ستون کروماتوگرافی تعویض یونی.. 37

شکل 2-3- نانو ذرات کیتوزان.. 42

شکل2- 2- مراحل تزریق BT به خرگوش جهت به دست آوردن آنتی­بادی اختصاصی ضد BT.. 43

شکل2-3- شناسایی پروتئین توسط روش دات بلات.. 44

شکل2-4- شناسایی پروتئین توسط روش وسترن بلات.. 46

شکل2-5- نحوه­ی بستن ساندویچ وسترن بلات.. 47

شکل2-6- الایزای غیرمستقیم.. 48

شکل2-7- دستگاه نانودراپ.. 53

شکل2-8- نقشه پلاسمید pTZ57R/T و مکان‌های برشی آن… 57

شکل2- 9- نقشه­ی pET-21a(+) Novagene)) و مکان­های برشی آن.. 64

شکل2-10- مراحل تزریق پروتئین نوترکیب rBTF5 جهت به دست آوردن آنتی­بادی   69

شکل2-11- واکنش متقاطع آنتی­ژن BT و rBTF5. 70

شکل3- 1- رشد باکتری کلستریدیوم پرفرنژنس تیپ B.. 72

شکل3- 2- بررسی فعالیت همولیزین… 73

شکل3-1- الکتروگرام الکتروفورز فراکسیون­های حاصل از ستون کروماتوگرافی تعویض کاتیونی… 74

شکل3-3- نمودار استاندارد تعیین وزن مولکولی پروتئین.. 75

شکل3-4- روش دات بلات جهت بررسی تولید آنتی­بادی اختصاصی ضد BT   76

شکل3-2- بررسی تولید آنتی­بادی اختصاصی ضد توکسین بتا.. 77

عنوان                                                                                                                                     صفحه­

شکل3-5- نتایج نمونه­های مختلف الیزای مسیر خالص­سازی.. 78

شکل3-6- نتایج اسپکتروگرام و الکتروفورز.. 79

شکل3-7- پیش­بینی ساختار دوم توکسین بتا به وسیله­ی نرم­افزار آنلاین PSIPRED   83

شکل3-9- تعیین غلظت محصول PCR خالص شده از ژل آگارز لوملتینگ 1%   87

شکل3-10- نتایج T/A کلونینگ.. 88

شکل3-12- نتیجه هضم آنزیمی دوگانهPET21(a+)  و pTZ57R/TF5… 90

شکل3-13- تعیین غلظت PET 21 بعد از  هضم آنزیمی و استخراج از روی ژل لوملتینگ   91

شکل3-17- نتایج دات بلات پروتئین‌rBTF5 با استفاده از آنتی­بادی اختصاصی   94

شکل3-18- الکتروگرام بررسی ابتدایی بیان پروتئین rBTF5 در ساعات مختلف   94

شکل3-19- ویژگی پروتئین نوترکیب rBTF5 تولید شده در E. coli 95

شکل3-20- ارتباط بین بیان آنتی­ژن rBTF5 در زمان­های مختلف القای بیان   96

شکل3-21- روش دات بلات جهت بررسی تولید آنتی­بادی اختصاصی ضد rBTF5…. 97

شکل3-22- بررسی تولید آنتی­بادیrBTF5  توسط وسترن بلات…… 98

شکل3-23- واکنش متقاطع دات بلات جهت مقایسه­ی آنتی­ژنسیته دو آنتی­ژن BT و rBTF5  99

شکل3-24- نتایج واکنش متقاطع در الیزا.. 100

شکل3-52- مقایسه اتصال آنتی­ژن BT و آنتی­ژن نوترکیب rBTF5 به  آنتی­بادی موشی و خرگوش… 101

شکل4-2- روش semi-empirical جهت پیش­بینی نواحی آنتی­ژنی توکسین بتا   106

فهرست جدول­ها

عنوان                                                                                                                                    صفحه

جدول1-1- خصوصیات توکسین­های اصلی کلستریدیوم پرفرنژنس.. 9

جدول2-1- راهنمای انتخاب درصد آکریل­آمید برای جداسازی پروتئین­ها بر اساس وزن ­مولکولی.. 38

جدول2-2- مواد و مقادیر لازم جهت تهیه ژل جدا­کننده12.5%  SDS-PAGE.. 39

جدول2-3- مواد و مقادیر لازم جهت تهیه ژل متراکم­کننده­4%  SDS-PAGE.. 40

جدول2-4- مواد و مقادیر مورد نیاز برای بافر  Runnigتانک SDS-PAGE.. 40

جدول2- 5- مواد و مقادیر مورد نیاز جهت تهیه محلول فیکساتیو.. 41

جدول2- 6- مواد مورد نیاز در تهیه محلول نیترات نقره.. 41

جدول2-7- مواد و مقادیر مورد نیاز جهت تهیه محلول رنگزا.. 41

جدول2-8- مواد و مقادیر مورد نیاز برای بافر­ تانک وسترن بلات.. 46

جدول2-9- ترکیبات محیط کشت LB مایع و جامد.. 54

جدول2-10- برنامه حرارتی واکنش زنجیره پلیمراز جهت تکثیر قطعات cbp  55

جدول2- 11- عناصر ژنتیکی ناقل pTZ57R/T.. 56

جدول2-12- مقدار محصول PCR پیشنهاد شده برای واکنش الحاق.. 59

جدول2-13- اجزای واکنش الحاق قطعه در ناقل pTZ57R/T.. 59

جدول2- 14- عناصر ژنتیکی ناقل pET-21a(+). 64

جدول2-15- اجزای واکنش هضم دوگانه پلاسمید نوترکیب pTZ57R/T حاوی قطعه مورد نظر.. 65

جدول2-17- اجزای واکنش الحاق.. 66

جدول3-1- سنجش درصد همولیز و فعالیت همولیزین غلظت­های مختلف توکسین بتا   73

جدول3-2- خلاصه­ای از مراحل خالص­سازی توکسین بتا کلستریدیوم پرفرنژنس تیپ B   75

جدول3- 2- پرایمرهای طراحی شده از توالی نوکلئوتیدی توکسین بتا   85

جدول3-3- قطعات قابل انتظار بر اساس پرایمرهای طراحی شده.. 85

نقد و بررسی‌ها

هنوز بررسی‌ای ثبت نشده است.

اولین کسی باشید که دیدگاهی می نویسد “تعيين اپي‏توپ‏هاي توكسين بتا كلستريديوم پرفرنژنس با استفاده از تکنيک‏هاي مولكولي  ”

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

قبلا حساب کاربری ایجاد کرده اید؟
گذرواژه خود را فراموش کرده اید؟
Loading...
enemad-logo